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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-11290
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1129/


Werber, Ingrid

Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Legumain-Gens im Modellsystem Maus

Investigations for structure and function of the Gene Legumain in the modelsystem mouse

Dokument1.pdf (3.320 KB) (md5sum: f11e141055126bf15ef08942e41bfbd1)

Kurzfassung in Deutsch

Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Legumain-Gens im Modellsystem Maus

Die Asparaginyl-Endopeptidase Legumain gehört zu den Cystein-Peptidasen und ist im Lysosomen aktiv. Zur Zeit ist sie der einzige Vertreter in der Peptidasefamilie C13 der Säuger. Ursprünglich wurde Legumain in Pflanzen (Bohnen, Leguminosen) und später in Wirbellosen entdeckt. Legumain ist ubiqutiär exprimiert und hat seine höchste Expressionsrate in der Niere und der Plazenta.
Zur Charakterisierung des genomischen Lokus und zur Identifikation von spezifischen in vivo Funktionen der Asparaginyl-Endopeptidase Legumain wurde im Rahmen dieser Arbeit der genomische Lokus des Legumain-Gens charakterisiert werden und eine für diese Peptidase defiziente Mauslinie durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen gewonnen. Zunächst wurde zur Vervollständigung der Genstruktur von Legumain genomische Fragmente aus der RPCI-21 Maus PAC-Bank isoliert und subkloniert, die 33 kb der Genregion abdecken. Mit diesen Plamidsubklonen konnte bis auf wenige hundert bp zusammen mit bereits bestehenden Plasmidsubklonen aus einer λ2001-Maus-Phagenbank der gesamte genomische Legumain-Lokus von ca. 45 kb isoliert und charakterisiert werden. So wurden 14 Exons und Introns identifiziert. Mit Hilfe eines RFLPs und einer interspezifischen Rückkreuzung wurde das Legumain-Gen wurde chromosomal am distalen Ende des Maus-Chromosoms 12 lokalisiert. Die Bestimmung des Transkriptionsstarts mit Primer-Extension ergab, daß ein singulärer Transkriptionsstart des Gens 223 Nukleotide vor Exon 1 liegt. Eine computergestützte Analyse der Promotorregion identifizierte putative Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, welche das Gen als ein mögliches Housekeeping Gen ausweisen.
Mit dem bestehenden Rekombinationskonstrukt pMLE-Neo1 wurden embryonale Stammzellen der isogenen ES-Zellinie HM-1 elektroporiert und der legumaindefiziente Mausstamm 3HLeg130 generiert. Die vollständige Inaktivierung des Gens wurde auf Transkriptions- Translations- und Proteinebene bestätigt. Die Mäuse sind lebensfähig. Es wurde versucht die in vivo Funktion des Legumain-Gens anhand der Knock-Out Mäuse zu analysieren. Dabei wurden von allen wichtigen Grundorganen histologische Präparate angefertigt, und die Knochenanatomie osteodensitometrisch und röntgenologisch bestimmt. Die legumaindefizienten Tiere sind fertil und zeigen in allen untersuchten Merkmalen keine Unterschiede zu Wildtypkontrolltieren. Eine breitangelegter Screen für dysmorphologische, klinisch-chemische, biochemisch-metabolische, immunologische und lysosomale Parameter wurde in Zusammenarbeit mit dem ENU Mutagenese Screen in München durchgeführt. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen allen drei Genotypgruppen der Legumain Mauslinie 3HLeg130 konnten für die beiden Parameter Carnitin und Arginin im biochemisch-metabolischen Screen durch Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie festgestellt werden. Sowohl die Werte für Carnitin als auch Arginin sind in der Gruppe der -/- Mäuse erniedrigt. Dies sind die ersten erkannten phänotypischen Merkmalsausprägungen des legumaindefizienten Mausstamms. Weitere in vivo Analysen in der Immunolgie durch Antigenpräsentations Assays widerlegten die Hypothese, daß Legumain eine maßgebliche Rolle bei der Prozessierung des mikrobiellen Antigen Tetanus Toxoid spielt.
Die Legumaindefizienz hat im murinen Organismus in allen untersuchten Parametern keine Auswirkungen, bis auf in Arginin und Carnitin.


Kurzfassung in Englisch

Legumain (Asparaginyl-Endopeptidase) belongs to the cysteine peptidases, predominantly located in the lysosomal compartment. As of today it is the only representative of peptidase family C13 in mammals.
It was first described in plants and subsequently in invertebrates. In mammalia legumain is ubiquitously expressed with highest levels in placenta and kidney. In vitro experiments suggest, that legumain is involved in MHC - class II - restricted antigen presentation. In addition legumain may inhibit osteoclast formation and bone resorption. Evidence for immunological in vivo functions of legumain are shown in experiments with human encephalitogenic myelin basic protein. Central tolerance of this epitop is not established because it is destructively processed by legumain which limits its display in the thymus.

Legumain was mapped on mouse chromosome 12 by using an interspecific backcross panel between C57BL/6J and mus spretus (BSS). To identify in vivo functions of legumain, a null-mutant was generated by gene targeting. Towards that end the murine gene was isolated and the exon/intron structure and the promotor region was characterized by computer based analysis. A replacement vector for targeted disruption containing a 8.4 kbp DNA fragment of the legumain-gene was constructed. As selectable marker a neomycin-cassette was introduced into an exonic location. Embryonic stem (ES) cells were transfected by electroporation. ES cells heterozygous at the legumain-gene locus were microinjected into blastocysts and several chimeric animals that transmit the altered locus were obtained. Heterozygotes were mated and first litters with viable descendants homozygous for the deficiency of legumain were born. The inactivation of legumain in the legumain-/- strain could be confirmed on transcription-, translation- and protein level.
Histological preparation of all basic organs and X-rays as well as osteodensitometric investigations of the skeleton did not reveal a difference between KO and wildtype animals. Analyses of the legumain null-mutant mice by means of a large scale screen (mutagenesis screen for dysmorphological, clinical-chemical, biochemical-metabolical, immunological and lysosomal parameters) resulted in a significant reduction of arginine and carnintine in peripheral blood for the null-mutant mice.
Antigen presentation assays with antigen presenting cells from the legumain-/- strain could not confirm the postulated role of legumain for processing the microbial tetanus toxin antigen.

The investigations of this thesis revealed a striking phenotype for the legumain-/- mice with reduced serum concentration of arginine and carnitine in peripheral blood.


SWD-Schlagwörter: Arginin , Carnitin , Homologe Rekombination , Antigenpräsentation , Phänotyp , Transkriptionsfaktor , MHC Klasse II , Säugetiere , Hausmaus , Embryona
Freie Schlagwörter (deutsch): Legumain , Asparaginyl-Endopeptidase (AEP) , in vivo Funktion , Genstruktur
Freie Schlagwörter (englisch): Legumain (Asparginyl-Endopeptidase AEP) , Cysteine-Peptidase , Gene Targeting , Arginine , Carnitine
Institut: Inst. für Molekulare Medizin und Zellforschung
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Peters, Christoph (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.07.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 12.01.2004
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