Direkt zum Inhalt | Direkt zur Navigation

Eingang zum Volltext

Lizenz

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-11388
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1138/


Hügler, Michael

Autotrophe CO2-Fixierung in thermophilen Mikroorganismen

Autotrophic CO2 fixation in thermophilic microorganisms

Dokument1.pdf (3.006 KB) (md5sum: 00b7d5f8e934b859d34a3336ebf61f59)

Kurzfassung in Deutsch

Derzeit sind bei Mikroorganismen vier verschiedene Stoffwechselwege zur autotrophen CO2-Fixierung bekannt. Dies sind der Calvin-Zyklus, der reduktive Citrat-Zyklus, der reduktive Acetyl-CoA-Weg und der 3-Hydroxypropionat-Zyklus. Letzterer wurde bisher nur im phototrophen Bakterium Chloroflexus aurantiacus nachgewiesen.
In den letzten Jahren wurden zahlreiche thermophile und hyperthermophile Vertreter der Crenarchaeota isoliert, die autotroph wachsen können. Es gibt sehr wenige Unter-suchungen zur autotrophen CO2-Fixierung in dieser großen Organismengruppe. Erste Arbeiten deuten auf einen 3-Hydroxypropionat-Zyklus in Vertretern der Familie der Sulfolobaceae hin.
In dieser Arbeit sollte der 3-Hydroxypropionat-Zyklus sowohl in C. aurantiacus, als auch in Metallosphaera sedula, einem Mitglied der Sulfolobaceae, näher untersucht werden. Außerdem wurde die Art der jeweiligen CO2-Fixierung in verschiedenen Vertretern der Crenarchaeota untersucht.
Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
1. Die Malonyl-CoA-Reduktase, ein charakteristisches Enzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus, wurde aus C. aurantiacus gereinigt und charakterisiert. Das entsprechende Gen wurde kloniert und sequenziert. Die Malonyl-CoA-Reduktase katalysiert die NADPH-abhängige, zweistufige Reduktion von Malonyl-CoA über Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionat. Da die Malonyl-CoA-Reduktase in keinem anderen Stoffwechselweg benötigt wird, kann sie als Schlüsselenzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus angesehen werden.
2. Es wurden in autotrophen Vertretern aller Familien der Crenarchaeota die Schlüssel-enzymaktivitäten der bekannten CO2-Fixierungswege untersucht. Bei Pyrodictium abyssi und Pyrodictium occultum (Pyrodictiaceae) wurde eine Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase-Aktivität nachgewiesen. Es wird ein modifizierter Calvin-Zyklus vermutet. In Ignicoccus islandicus und Ignicoccus pacificus (Desulfurococcaceae) konnte nur die Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase als Enzym eines bekannten CO2-Fixierungswegs nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sprechen für einen neuartigen, bisher unbekannten CO2-Fixierungsweg in dieser Familie. In den Vertretern der Sulfolobaceae, Acidianus ambivalens, M. sedula und Sulfolobus sp. VE 6, konnten Aktivitäten der Schlüsselenzyme des 3-Hydroxypropionat-Zyklus nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte in M. sedula und Sulfolobus sp. VE 6 auch die Aktivitäten der ?-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase gemessen werden. Die Sulfolobaceae haben demnach vermutlich einen modifizierten 3-Hydroxypropionat-Zyklus. Bei Pyrobaculum islandicum (Thermoproteaceae) wurden nur die Schlüsselenzyme des reduktiven Citrat-Zyklus gefunden, der hier vermutlich als autotropher CO2-Fixierungsweg dient.
3. Die Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase-Aktivität in Pd. abyssi und Pd. occultum wurde näher charakterisiert. Über HPLC-Analyse konnte 3-Phosphoglycerat als primäres CO2-Fixierungsprodukt nachgewiesen werden. Das Enzym war noch in kochendem Wasser aktiv und scheint, wie die anderen RubisCO-Proteine der Archaea, ein Enzym der Form III zu sein.
4. Der 3-Hydroxypropionat-Zyklus in M. sedula wurde näher charakterisiert, indem die Regulation von Enzymen des zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsels untersucht wurde. Die Aktivitäten wichtiger Enzyme des 3-Hydroxypropionat-Zyklus waren unter autotrophen Wachstumsbedingungen hochreguliert, ebenso die ?-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase und die Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase. Die Enzyme des Citrat-Zyklus waren dagegen unter heterotrophen Wachstumsbedingungen hochreguliert.
5. Um eine eventuelle Beteiligung der ?-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase an der autotrophen CO2-Fixierung in M. sedula zu überprüfen, wurden 13C-Markierungsexperimente in M. sedula durchgeführt. Autotroph wachsende Zellen wurden mit 13C-Succinat gefüttert und das 13C-Markierungsmuster der isolierten Aminosäuren analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Beteiligung der ?-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase an der autotrophen CO2-Fixierung ausgeschlossen ist. Gleichzeitig unterstützte der Vergleich der 13C-Makierungsmuster von M. sedula und C. aurantiacus die These eines alternativen Wegs der Acetyl-CoA-Regeneration.
6. Die Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase, das CO2-fixierende Enzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus, wurde aus M. sedula gereinigt und charakterisiert. Sie ist aus 3 Untereinheiten (Biotincarboxylase AccB, Biotin-Carrier-Protein AccC, Carboxyltransferase PccB) aufgebaut und katalysiert beide Carboxylierungsreaktionen mit der gleichen Rate. Im Gegensatz zu den Carboxylasen der meisten anderen Organismen ist das Enzym aus M. sedula stabil und konnte als Holoenzym gereinigt werden. Wahrscheinlich hat es eine (AccB, AccC, PccB)4-Struktur. Das Enzym aus M. sedula wäre ein ideales Objekt für die Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse dieses wichtigen Enzyms. Es konnte bestätigt werden, dass die vermuteten Gensequenzen von M. sedula für diese Carboxylase codieren.


Kurzfassung in Englisch

In prokaryotes four different autotrophic pathways for CO2 fixation are known. These are Calvin cycle, reductive TCA cycle, reductive acetyl-CoA pathway and 3-hydroxypropionate cycle. The latter pathway was recently discovered in the phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus. The 3-hydroxypropionate cycle involves the carboxylation of acetyl-CoA to malonyl-CoA, which is then reductively converted to propionyl-CoA via 3-hydroxypropionate. In a second carboxylation reaction methyl-malonyl-CoA is formed from propionyl-CoA, followed by the isomerization of methyl-malonyl-CoA to succinyl-CoA. Malyl-CoA is formed from succinyl-CoA and the cleavage of malyl-CoA leads to acetyl-CoA and the CO2 fixation product glyoxylate.
During the last years many thermophilic and hyperthermophilic crenarchaeota capable of autotrophic growth have been isolated. However, at present there are only few studies that have investigated their autotrophic CO2 fixation pathways. At the start of this thesis, there were some indications for the operation of the 3-hydroxypropionate cycle in members of the Sulfolobaceae.
This thesis aimed at further elucidating the 3-hydroxypropionate cycle in C. aurantiacus as well as in Metallosphaera sedula, a member of the Sulfolobaceae. Furthermore, representative species of Crenarchaeota were examined to determine their autotrophic CO2 fixation pathways. The thesis resulted in the following findings:
(1) Malonyl-CoA reductase, a key enzyme of the 3-hydroxypropionate cycle was purified and characterized from cells of C. aurantiacus. The corresponding gene was cloned and sequenced. This enzyme catalyses the NADPH-dependent reduction of malonyl-CoA to 3-hydroxypropionate and is therefore a bifuncional enzyme.
(2) Autotrophic members from all families of Crenarchaeota were examined for key enzymes of the known autotrophic CO2 fixation pathways. In Pyrodictium abyssi and Pyrodictium occultum (Pyrodictiaceae) a ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase activity was found. These organisms may use a modified Calvin cycle for CO2 fixation. Ignicoccus islandicus and Ignicoccus pacificus lacked key enzymes of known pathways. They may use a novel, so far unknown pathway for CO2 fixation. In members of Sulfolobaceae (Acidianus ambivalens, M. sedula and Sulfolobus sp. VE 6) key enzymes of the 3-hydroxypropionate cycle were found, confirming the initial results. Since malyl-CoA lyase activity could not be demonstrated, these organisms may use a modified 3-hydroxypropionate cycle for autotrophic carbon fixation. The regulation of enzymes of the central carbon metabolism in M. sedula was studied. The results of these measurements strongly support the occurrence of a modified 3-hydroxypropionate cycle in M. sedula. Pyrobaculum islandicum (Thermoproteaceae) contained all key enzymes of the reductive TCA cycle.
(3) Acetyl-CoA/propionyl-CoA carboxylase, the CO2 fixing enzyme of the 3-hydroxypropionate cycle was purified and characterized from cells of M. sedula. The enzyme contains 3 subunits (biotin carboxylase, biotin carrier protein, carboxy-transferase) and catalyses the carboxylation of acetyl-CoA and propionyl-CoA. In contrast to the acetyl-CoA carboxylase of most other organisms, acetyl-CoA/propionyl-CoA carboxylase from M. sedula could be isolated as a stabile functional enzyme complex. It therefore may prove an ideal subject for further structural studies.


SWD-Schlagwörter: CO2-Fixierung , Archaea , autotroph , thermophil
Freie Schlagwörter (deutsch): 3-Hydroxypropionat-Zyklus
Freie Schlagwörter (englisch): CO2 fixation , Archaea , autotrophic , thermophilic , 3-hydroxypropionate cycle
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Fuchs, Georg (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.12.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 08.11.2004
Bemerkung: Hügler, M., C. Menendez, H. Schägger, and G. Fuchs. 2002. Malonyl-coenzyme A reductase from Chloroflexus aurantiacus, a key enzyme of the 3-hydroxypropionate cycle for autotrophic CO2 fixation. J. Bacteriol. 184:2404?2410.
Hügler, M., H. Huber, K.O. Stetter, and G. Fuchs. 2003. Autotrophic CO2 fixation pathways in Archaea (Crenarchaeota). Arch. Microbiol. 179:160?173.
Hügler, M., R.S. Krieger, M. Jahn, and G. Fuchs. 2003. Characterization of acetyl-CoA/ propionyl-CoA carboxylase in Metallosphaera sedula. Carboxylating enzyme in the 3-hydroxypropionate cycle for autotrophic carbon fixation. Eur. J. Biochem. 270:736?744.
Indexliste