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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-12069
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1206/


Momm, Joachim

Herstellung und Charakterisierung von unsymmetrischen Liposomen unter Verwendung von rekombinanten Proteinen

Production and characterisation of asymmetrical liposomes using recombinant proteins

Dokument1.pdf (4.218 KB) (md5sum: 7836fea908daea09d0a01239216959f0)

Kurzfassung in Deutsch

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Herstellung und Charakterisierung von Liposomen, die eine unsymmetrische Lipidverteilung zwischen dem inneren und äusseren Monolayer aufweisen.
Liposomen werden aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit zellulären Membranen in der Forschung häufig als Biomembran-Modelle herangezogen, um verschiedenste Vorgänge, die in und an Membranen stattfinden, isoliert zu untersuchen. Die dafür eingesetzten Liposomen müssen verschiedene Anforderungen erfüllen, um der sehr komplexen Situation an zellulären Membranen in Ansätzen Rechnung zu tragen. Viele natürliche Membranen zeigen eine unsymmetrische Verteilung verschiedener Lipide zwischen den beiden Monolayern. Bekanntestes Beispiel ist die humane Erythrozytenmembran, bei der sich die Aminophospholipide Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) hauptsächlich im inneren Monolayer aufhalten, während die cholinhaltigen Lipide Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin mehr im äusseren Monolayer zu finden sind.
Die Unsymmetrie sollte unter Verwendung von rekombinant aus E. coli gewonnenen Proteinen erzeugt werden. Dabei wurden zwei verschiedene Methoden angewandt: der Lipidaustausch zwischen zwei Liposomenpopulationen und die enzymatische Modifizierung der Liposomenoberfläche.
Der Lipidaustausch zwischen sogenannten Donorliposomen (90 mol% PC, 10 mol% PS bzw. Phosphatidylglycerol, PG) und Akzeptorliposomen (100 mol% PC), der normalerweise sehr langsam stattfindet (t½ = mehrere Tage) konnte unter Verwendung des rekombinant in E. coli gewonnenen nichtspezifischen Lipidtransfer-proteins (ns-LTP) aus der Rattenleber um ein Vielfaches beschleunigt werden. Liposomen, die in ihrem Inneren ein im Bilayer verankertes zweidimensionales Polymernetzwerk (künstliches Zytoskelett) enthalten, wiesen im Vergleich zu normalen Liposomen einen deutlich schnelleren spontanen und auch protein-vermittelten Lipidaustausch auf.
Eine nachfolgende Trennung der beiden Liposomenpopulationen gelang über die Free Flow Elektrophorese (FFE). Bei der FFE handelt es sich um eine trägerfreie Elektrophorese, bei der Proben in einem laminaren Pufferstrom aufgetrennt und in 96 Fraktionen gesammelt werden, wodurch sie für nachfolgende Untersuchungen weiter zur Verfügung stehen. So wurde unter anderem die transversale Diffusion von PG und PS (Flipp-Flopp) über Zetapotentialmessungen und die Fluoreszenzsonde 2-(p-Toluidinyl)naphthalen-6-sulfonsäure (TNS) bestimmt. Die Halbwertszeiten des PG-Flipp-Flopp lagen bei 10 bis 20 h, die des PS-Flipp-Flopp bei etwa 3,5 h.
Zur enzymatischen Modifizierung der Liposomenoberfläche wurde die E. coli Phosphatidylserin-Decarboxylase (PSD) als Fusionsprotein mit der Glutathion-S-Transferase in E. coli hergestellt. Das Enzym beschleunigt die Umwandlung von PS zu PE. Aufgrund seiner Grösse vermag es liposomale Membranen nicht zu durch-dringen, wodurch nur im äusseren Monolayer vorliegendes PS modifiziert wird. Dadurch wird bezüglich PS und PE eine Unsymmetrie zwischen den beiden Monolayern generiert.


Kurzfassung in Englisch

Liposomes are widely used as drug carriers or as a system to mimick biological membranes. Their structural similarity to natural membranes makes them a suitable tool to investigate various physiological processes like membrane fusion, cell-cell recognition or cellular uptake mechanisms and to study protein activity and behaviour in bilayers. Furthermore, several drug-membrane interactions (association, binding, transbilayer movement, partitioning, pore formation) can be analysed as well as incorporation and activity of various membrane proteins or protein complexes.
In order to provide an accurate liposomal model for biological membranes, three features that strongly affect the behaviour of these systems have to be considered: the supporting cytosolic membrane skeleton, the lipid composition of the membranes and the lipid distribution between the two leaflets of the bilayer. Lipid asymmetry can influence various biophysical properties of the vesicles like packing density of the monolayers, membrane permeability, surface charge, membrane potential and viscoelasticity. Most of the biological membranes exhibit an asymmetric transbilayer lipid distribution. It has been shown for the human erythrocyte membrane, the platelet plasma membrane, the Golgi complex and lysosomes
In this study, liposomes with an asymmetrical distribution of egg phosphatidylglycerol (EPG) and egg phosphatidylserine (EPS) were prepared by lipid exchange between two liposomal preparations using a recombinant nonspecific lipid transfer protein (ns-LTP). The liposomes were separated by free flow electrophoresis (FFE) and transbilayer EPG and EPS movement (flip: inward; flop: outward) was detected by several techniques.
Free Flow Electrophoresis (FFE) is an electrophoretic procedure working continuously in the absence of a stationary phase (or solid support material such as a gel). It separates charged particles ranging in size from molecular to cellular dimensions according to their electrophoretic mobilities. Samples are injected continuously into a thin buffer film flowing through a chamber formed by two narrowly spaced glass plates. Perpendicularly to the electrolyte and sample flow, current may be applied while the fluid is flowing (continuous FFE).
Furthermore, phosphatidylserine decarboxylase was cloned and expressed in e. coli. It could be shown that the enzyme converts PS located in the outer monolayer of vesicles into phosphatidylethanolamine (PE) thus producing liposomes with an asymmetrical lipid distribution.


SWD-Schlagwörter: Liposom , Asymmetrie , Phospholipide , Proteine , Freie Elektrophorese
Freie Schlagwörter (deutsch): Lipidunsymmetrie , Free Flow Elektrophorese , Lipidtransferprotein , Flipp Flopp
Freie Schlagwörter (englisch): vesicles, free flow electrophoresis , sterol carrier protein 2 , transbilayer distribution , flip-flop
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schubert, Rolf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.01.2004
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 04.03.2004
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