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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-12642
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1264/


Faltusz, Alexander

Molekulare und funktionelle Analyse von P-Typ-Kalzium-ATPasen im Laubmoos Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.

Molecular and functional analysis of P-type calcium ATPases in the moss Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.

Dokument1.pdf (2.294 KB) (md5sum: 7a1bfa9daae27544aea8c8a0ac4b08bd)

Kurzfassung in Deutsch

Das Laubmoos Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. diente in der vorliegenden Arbeit als Modellsystem zur Untersuchung von P-Typ-Kalzium-ATPasen und ihrem Einfluss bei der Entwicklung von Pflanzen. Diese auch als Kalziumpumpen bezeichneten Proteine sind in den letzten Jahren in Tieren und Höheren Pflanzen näher charakterisiert worden. Aus Niederen Pflanzen lagen bisher keine Daten für Vertreter der autoinhibitorischen P2B-Kalzium-ATPasen vor.

In EST-Datenbanken wurden drei Homologe von Physcomitrella-Ca2+-ATPasen (PCA) identifiziert. Die vollständigen codierenden Sequenzen von zwei der drei Gene, pca1 und pca2, konnten dabei durch 5’-RACE-PCR und durch Datenbankanalysen identifiziert werden. Der Vergleich der Aminosäuresequenzen mit Mitgliedern von Ca2+-ATPasen aus Höheren Pflanzen mittels Stammbaum- und Motivanalysen bekräftigte die Einordnung von PCA1 und PCA2 in die Gruppe der P2B-Kalzium-ATPasen.
Die Berechnung der dreidimensionalen Struktur der beiden Proteine erfolgte durch Vergleich mit der bekannten Struktur von Oc-SerCa1, einer P2A-Kalzium-ATPase aus Kaninchen. Dabei wurden Modelle von PCA1 und 2 mit vergleichbarer 3D-Struktur erstellt.
Die Bestimmung der genomischen Sequenz von pca1 zeigte, dass der Aufbau des Gens nahezu unverändert in vergleichbaren Genen von Arabidopsis thaliana vorhanden ist.
Durch Expression eines pca1::gfp-Fusionsgens wurde PCA1 in Protoplasten von Physcomitrella lokalisiert. Das Fusionsprotein konnte in Strukturen nachgewiesen werden, die den kleinen Vakuolen aus Höheren Pflanzen ähnlich sind.
Die Ca2+-transportierende Funktion von PCA1 wurde nach Entfernung der autoinhibitorischen Domäne durch Komplementation von Hefemutanten bestätigt. Dabei konnte auch der Einfluss von PCA1 bei der Kompensation von Salzstress in Hefe gezeigt werden.
Für die funktionelle Analyse von PCA1 in Physcomitrella wurde dessen Genexpression untersucht. Eine Beeinflussung der Transkriptmenge durch Zugabe von Cytokinin oder Zucker konnte dabei nicht nachgewiesen werden.
Mittels gezielter Disruption des pca1-Gens wurden drei Knockout-Pflanzen hergestellt und verschiedenen Versuchsbedingungen ausgesetzt, um die resultierende Veränderung des Phänotyps beschreiben zu können. Dabei zeigte sich, dass NaCl-Stress, Kalziummangel oder die Zugabe von Schwermetallsalzen keine visuelle Veränderung des Phänotyps der K.O.-Pflanzen im Vergleich zum Wildtyp erbrachte.
Die Beobachtung von sich regenerierenden Protoplasten über einen längeren Zeitraum ergab jedoch, dass bei den K.O.-Pflanzen die Zahl der gebildeten Gametophoren vermindert war.

Dies führte zum Schluss, dass die P2B-Kalzium-ATPase PCA1 eine wichtige Rolle bei der Homöostase der cytoplasmatischen Kalziumkonzentration spielt und indirekt an der Entwicklung von Gametophoren in Physcomitrella patens mitwirkt.


Kurzfassung in Englisch

The moss Physcomitrella patens was used as a model organism for the study of P-type calcium ATPases and their influence on plant development. These proteins also known as calcium pumps have been characterised more closely during the last years in animals and higher plants. Until now there have not been any data available for members of the family of autoinhibited P2B calcium ATPases in lower plants.
Three homologues of Physcomitrella Ca2+-ATPases (PCA) were identified from EST-databases. The complete coding sequences of pca1 and pca2 were identified by RACE-PCR and database analyses. Comparison of aminoacid sequences to Ca2+-ATPases of higher plants by analysing phylogenetic trees and motifs, affirmed the classification of PCA1 and PCA2 as members of P2B calcium ATPases.
Threedimensional models of both proteins were calculated by comparison to the known structure of Oc-SerCa1, a P2A calcium ATPase of rabbit, revealing similar structure. Analysis of the genomic sequence of PCA1 indicated, that the gene structure is almost unaltered in comparable genes of Arabidopsis thaliana.
PCA1 was localised in protoplasts of Physcomitrella via expression of a fusion of the coding sequences of pca1 and gfp. The resulting fusion protein was observed in structures similar to small vacuoles in higher plants.
The Ca2+-transport function of PCA1 was confirmed by complementation of mutant yeast strains after removal of its autoinhibitory domain. The influence of PCA1 on the compensation of salt sress in yeast was also demonstrated.
An analysis of the expression of pca1 in Physcomitrella wildtype showed no influence of added cytokinine or sugar on the quantity of transcript.
Three knockout plants were created by targeted disruption of the pca1 locus and were tested on different conditions in order to describe changes in the phenotype. Saltstress, lack of calcium or the addition of heavy metal salts did not show visual changes of the phenotype of K.O.-plants compared to wildtype.
However, regeneration of protoplasts over a longer period revealed a reduced number of developed gametophores in the K.O.-plants.

It is concluded that the P2B calcium ATPase PCA1 plays a role in homeostasis of the cytoplasmic calcium concentration and is indirectly linked to the development of gametophores in Physcomitrella patens.


SWD-Schlagwörter: Calcium , P-Typ-ATPasen , Calcium-ATPasen , Physcomitrella patens , Laubmoose , Saccharomyces cerevisiae
Freie Schlagwörter (deutsch): Pumpe
Freie Schlagwörter (englisch): calcium , P-type-ATPase , Physcomitrella patens , calcium pump , yeast
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Reski, Ralf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.01.2004
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 29.04.2004
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