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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-12970
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1297/

Schandelmaier, Kathrin

Charakterisierung von Schlüsselproteinen der Signaltransduktion (EGF-R, c-erbB2, Hsp90) in humanen Tumorxenografts mittels Gewebemikroarray

Characterization of signal transduction key proteins (EGF-R, c-erbB2, Hsp90) in human tumor xenografts using tissue microarrays

Kurzfassung in Deutsch

Durch die nahezu komplette Entschlüsselung des humanen Genoms und durch die Anwendung von Hochdurchsatz Screening auf Gen-Ebene sind viele neue krankheitsrelevanten Gene entdeckt worden. Die Charakterisierung und Validierung dieser therapeutischen „Targets“ auf Proteinebene stellen bisher den zeitlimitierenden Schritt in der präklinischen Entwicklung neuer Behandlungsmethoden, bzw. Diagnose- oder Prognosemarker dar. Eine neue vielversprechende Technik sind hierbei Gewebemikroarrays, die von Kanonen et al. 1998 zum ersten Mal beschrieben wurden.
Die Freiburger Xenograft-Sammlung besteht aus mehr als 350 Tumormodellen. Patiententumoren werden subkutan in Nacktmäuse implantiert und in Serienpassage etabliert. Patientendaten, wie klinische und pathologische Eigenschaften, sowie das Ansprechen der Tumoren auf Standardzytostatika im Patienten und in der Maus sind bekannt.
Schlüsselproteine der Signaltransduktion (EGF-R, c-erbB2, Hsp90) wurden in dieser Arbeit untersucht. Überexpression dieser Proteine in Tumoren geht mit schlechter Prognose für die Patienten einher. EGF-R und c-erbB2 sind deshalb interessante Targets für neue molekulare Tumortherapien. Spezifische Inhibitoren, wie Hercptin und der humanisierte monoklonale Antikörper EMD72000 wurden entwickelt. Das Geldanamycin Derivat 17-AAG (17-allylamino-geldanamycin) befindet sich in klinischer Phase Studien in England und den USA. Es hemmt die Interaktion des Hsp90 mit anderen Proteinen.

In der vorliegenden Arbeit wurden Schlüsselproteine der Signaltransduktion (EGF-R, c-erbB2, Hsp90) in humanen Xenografts anhand der neuartigen Gewebemikroarray-Technologie charakterisiert. Die Gewebemikroarray-Methode wurde erstmalig bei Xenografts etabliert. Bis zu 150 Tumorgeweben wurden in Duplikaten gleichzeitig immunhistochemisch gefärbt und untersucht. Des Weiteren sollte eine mögliche Korrelation der bestimmten Proteinexpressionen untereinander, sowie mit Patientendaten analysiert werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, eine geeignete Auswahl an Nacktmausmodellen für die in vivo Testung von neuen Hemmsubstanzen der Signaltransduktionskaskade (EMD72000, 17-AAG) zu bestimmen, um anschließend Therapieversuche durchzuführen. Während und nach der Therapie sollten Targetprotein-Spiegel in Tumorgeweben mittels Gewebemikroarrays untersucht werden, um so ein Ansprechen auf molekularer Ebene zu belegen.

Hohe EGF-R Spiegel konnten in den Kopf-Hals-, den Nieren- und den Adenokarzinomen der Lunge gefunden werden. Unter 149 Xenografts wurden 19 EGF-R positive Modelle zur Testung target-orientierter Therapien identifiziert. C-erbB2 wurde in Blasen-, Kolon-, großzelligen Lungen- und Kopf-Hals- sowie in 45% der Mammakarzinome überexprimiert. Die Daten ergaben, daß möglicherweise mehr als ein Drittel aller Tumorpatienten von einer anti-c-erbB2 Therapie profitieren könnte. Bei Xenografts von nicht-kleinzelligen Lungen-, Kopf-Hals- sowie Pankreastumoren konnte eine deutliche Überexpression von Hsp90 nachgewiesen werden. Erhöhte Bcl-2 Werte wurden in Kolon-, Magen-, Adeno- und großzelligen Lungenkarzinomen erkannt.
Die Überlebenszeiten der Spenderpatienten mit EGF-R oder c-erbB2 positiven Tumoren war im Vergleich zu Patienten mit negativen Tumoren signifikant kürzer (P<0,05). Eine signifikante Koexpression zwischen Hsp90 und c-erbB2 wurde ermittelt (R = 0,48, P < 0,0001) und mit der Doppelfärbe-Methode dargestellt.
Nach Auswahl geeigneter Nacktmausmodelle wurde der therapeutische EGF-R Antikörper EMD72000 und das Hsp90 modulierende Geldanamycin Derivat 17-AAG in vivo in der Nacktmaus getestet. EMD72000 hemmte das Wachstum aller drei targetüberexprimierenden Nacktmausmodelle. Die Behandlung des gegen Standarszytostatika resistenten Magen- und des Adenokarzinoms der Lunge führte zu Vollremissionen. 17-AAG wurde an 8 Modellen getestet, von denen 6 in vitro und in vivo sensitiv waren. Während und nach der Therapie konnte eine Verminderung der Hsp90 Expression nachgewiesen werden.

Durch Kombination der Gewebemikroarray-Technik und der Freiburger Xenograft Sammlung konnte in kurzer Zeit eine große Anzahl von Tumoren hinsichtlich der Expression vieler Proteine charakterisiert werden. Eine optimale Auswahl von Tumormodellen für die Testung neuer Target-gerichteter Therapien wurde getroffen und die Modulation der Zielprotein-Expressionen wurde analysiert. Gewebemikroarrays können den Weg von der Grundlagenforschung im Labor zum Patienten in der Klinik drastisch beschleunigen.

Kurzfassung in Englisch

Recent advances in oncogenomics have led to the discovery of a vast amount of cancer related genes. Latter might prove valuable therapeutic targets or markers for diagnosis and prognosis of cancer. However, their characterisation and validation is still very time-consuming. To accelerate the evaluation of gene expression in multiple tumor types and to examine target modulation, I have employed tissue microarrays of human tumor xenografts.
The Freiburg xenograft collection comprises more than 400 human tumors of over 20 different organs which grow subcutaneously in serial passage in nude mice. Patient characteristics such as tumor grade, stage, survival and the response to standard therapeutic agents in patient and mouse are known.
The expression of signal transduction key proteins (EGF-R, c-erbB2, Hsp90) was investigated in this study. High expression of those proteins in tumors has been shown to correlate with a poor patient survival. Thus, they represent interesting new molecular targets. Specific inhibitors of the erbB pathway, such as Herceptin™ and the humanized monoclonal antibody EMD72000 were developed. The geldanamycin derivate 17-AAG (17-allylamino-geldanamycin) has recently entered clinical trials in the US and the UK. Its proposed mechanism of action is Hsp90 inhibition.

This study was aimed to analyse the expression pattern of signal transduction key proteins (EGF-R, c-erbB2, Hsp90) in a panel of 150 xenografts derived from human tumors by using IHC of tissue microarrays. Furthermore I have investigated whether a correlation exits between protein levels of EGF-R, c-erbB2, Hsp90 and the patient survival rate. Finally I have assessed the molecular effects of EMD 72000 and 17-AAG in responsive xenograft biopsies.

EGF-R was up-regulated in tumors of the head- and neck, in lung adenocarcinomas and renal tumors. Nineteen tumor models with high EGF-R pattern can be consequently proposed for target based drug testing. High c-erbB2 levels were detected in bladder, colon, large cell lung carcinomas, head and neck tumors and in 45% of the breast cancers. These data suggest that 30 % of the examined tumors could benefit from anti-c-erbB2 treatment. Xenografts of non-small cell lung cancers, head- and neck and pancreatic tumors showed high Hsp90 levels. Substantial Bcl-2 expression was observed in colon, gastric, adeno- and large cell lung cancrs.
The expression of EGF-R or c-erbB2 showed significant correlations with patient survival rates (P<0,05). Significant co-expression of Hsp90 and c-erbB2 was shown (R = 0,48, P < 0,0001).

Three xenograft models which did not respond to common chemotherapy but expressed high amounts of EGF-R were treated with humanized mab EMD72000. Growth inhibition and even complete remission was seen. 17-AAG was tested in 8 xenograft models. Six of them were sensitive in vitro and in vivo.Down-regulation of Hsp90 was observed during and after therapy.

Using tissue microarray technology, 150 human xenografts have been characterised rapidly regarding signal transduction key proteins.
An optimal selection for new-target drug testing has been made and the modulation of target expression was monitored during and after the therapy.
Tissue microarrays can accelerate the transition from basic scientific knowledge into clinical application by means of high throughput target validation and parallel analyses of multiple tumor types.