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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-13415
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1341/


Schmohl, Korinna

Identifikation von Interaktionsproteinen des humanen MxA-Proteins und Untersuchung der inhibitorischen Wirkung von Mx-Proteinen auf die Replikation des Influenza-A-Virus

Identification of interacting proteins of the human MxA protein and examination of the inhibitory effect of Mx proteins on the replication of Influenza A Virus

Dokument1.pdf (5.462 KB) (md5sum: 3a39f6e9cdbc50d23644ff1272d71ecd)

Kurzfassung in Deutsch

Mx-Proteine gehören zur Superfamilie der Dynamin-ähnlichen großen GTPasen. Sie sind Teil der frühen angeborenen Abwehr gegen Virusinfektionen bei Verte-braten, welche die Vermehrung von Pathogenen aufhält, bis die spezifische Immun-antwort einsetzt. Die Expression von Mx-Proteinen wird durch Typ-I-IFN induziert und hemmt die Replikation verschiedener Viren mit negativsträngigem RNA-Genom oder mit RNA-Intermediaten während des Replikationszyklus, darunter z. B. das humanpathogene Influenza-A-Virus (FLUAV). Der Mechanismus der antiviralen Aktivität von Mx-Proteinen ist auf molekularer Ebene noch nicht aufgeklärt.
Um Hinweise auf den antiviralen Mechanismus zu bekommen, wurde im ersten Teil dieser Arbeit nach zellulären Interaktionspartnern des humanen MxA gesucht. Dazu wurde FLAG-MxA aus einer konstitutiv exprimierenden Zelllinie mit Hilfe von anti-FLAG-Agarose präzipitiert und zusammen mit den gebundenen Proteinen im 2D-Gel aufgetrennt. Von den spezifisch kopräzipitierten Proteinen konnten das Hitzeschock-Protein Hsp60 und b-Tubulin mittels MALDI-TOF-MS Peptid-Fingerprint-Analyse als potentielle Interaktoren von FLAG-MxA identifiziert werden. Während Hsp60 als Chaperon wahrscheinlich am Faltungs-prozess von neu synthesiertem MxA beteiligt ist, könnte Tubulin eine Rolle bei der intrazellulären Lokalisation von MxA spielen.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die antivirale Aktivität von nukleärem mMx1 und zyto-plasmatischem MxA gegen FLUAV in einem Minireplikonsystem charakterisiert. Dabei wurden virale Ribonukleoprotein-Komplexe (vRNPs), die minimale virale Transkriptions- und Replikationseinheit, durch die Expression aller Komponenten von klonierten cDNAs rekonstituiert und ihre Aktivität durch den Einsatz eines künstlichen viralen Genomsegments mit einem Reportergen (Minigenom) quantifiziert. Die Untersuchungen zeigten, dass Mx-Proteine eine 50- bis 100-fach effizientere Wirkung gegen FLUAV entfalten, wenn sie wie mMx1 im Kern lokalisiert sind, dem Ort der viralen Replikation und Transkription. Darüber hinaus werden längere Minigenome stärker gehemmt als kurze. Die Hemmung durch mMx1 konnte durch die Überexpression einzelner Komponenten des vRNP nicht aufgehoben werden. Es ist deshalb unwahrscheinlich, dass mMx1 mit freien viralen Proteinen des vRNP interagiert. Die Ergebnisse weisen vielmehr darauf hin, dass mMx1 vollständige replikations- und transkriptions-aktive vRNPs erkennt und über einen direkten oder indirekten Mechanismus die Elongation bei der viralen RNA-Synthese inhibiert.


Kurzfassung in Englisch

Mx proteins are members of superfamily of dynamin-like large GTPases. They are part of the early innate immune response against viral infections in vertebrates, thus counteracting the spread of pathogens before the specific immune response sets in. Induced by type I interferons Mx proteins inhibit the replication of viruses with negative-stranded RNA genomes, or with RNA intermediates during their replication cycle. Among these is the prominent human pathogen influenza A virus (FLUAV). However, the molecular mechanism by which Mx proteins mediate the antiviral effect is still unclear.
First, to gain insights into the antiviral mechanism I searched for cellular interaction partners of the human MxA protein. Using anti-FLAG agarose FLAG-tagged MxA and potentially MxA-bound proteins were precipitated from a cell line constitutively expressing FLAG MxA, and subsequently separated on a 2D protein gel. Among the specifically coprecipitated proteins heatshock protein Hsp60 and b-tubulin could be identified as potential interaction partners of FLAG MxA as revealed by MALDI-TOF-MS peptide fingerprint analysis. While Hsp60 might work as a chaperone during the folding of newly synthesized MxA, tubulin could play a role for the intracellular localization of MxA.
In the second part of this work the antiviral activity of nuclear mMx1 and cytoplasmic MxA against FLUAV was characterized in a minireplicon system. In this system the minimal unit required for viral transcription and replication, the viral ribo-nucleo-protein complex (vRNP), is reconstituted by expressing all components from cloned cDNAs. Quantification of the respective activities was achieved by the use of artificial genome segments with reporter genes (minigenomes). The investigations showed, that the Mx protein-dependent antiviral effect against FLUAV is 50- to 100-fold more potent when, like mMx1, expressed in the cell nucleus, the site of viral replication and transcription. Furthermore, longer minigenomes were more efficiently inhibited than shorter ones. The mMx1 dependent inhibition could not be overcome by overexpression of single vRNP components. A direct interaction of mMx1 with free viral vRNP protein components is therefore unlikely. The results rather indicate that mMx1 recognizes complete replication- and transcription-active vRNPs and inhibits the elongation of the viral RNA synthesis by a direct or indirect mechanism.


SWD-Schlagwörter: Mx-Protein , antiviral , Influenza A
Freie Schlagwörter (englisch): Mx protein , antiviral , Influenza A
Institut: Inst. für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Haller, Otto (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.06.2004
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 25.06.2004
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