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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-14144
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1414/


Zickler, Philipp Patrick

Molekulare Analysen zur Pluripotenz und Langzeitaktivität retroviral transduzierter hämatopoetischer Stammzellen

Molecular analysis of pluripotency and long term activity of retrovirally transduced hematopoietic stem cells

Dokument1.pdf (2.810 KB) (md5sum: 17246d62145cf1888ad11a743fc48059)

Kurzfassung in Deutsch

Adulte Blutstammzellen besitzen ein enormes Regenerationspotential. Ihre genaue Anzahl, Aktivitätsdauer sowie der quantitative Anteil individueller Klone an der Hämatopoese bei Großtieren oder dem Menschen sind jedoch nicht bekannt. Ob die Regenerationsfähigkeit auch Zelltypen außerhalb des hämatopoetischen Systems einschließt oder derartige Plastizitätsphänomene nur vorgetäuscht sind, ist derzeit unklar. Daher sind neue Methoden zur Analyse des in vivo Verhaltens von Stammzellen auf Einzelklonniveau notwendig.
In der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig hochsensitive Methoden zur direkten quantitativen Klonalitätsanalyse individueller genmarkierter Stammzellen in einem HeLa-Tumorzellen-Modell entwickelt. Anschließend wurde die in vivo Hämatopoese eines mit transduzierten CD34+-Zellen transplantierten Rhesusaffen untersucht. Die genomische Integrationsstelle retroviraler Vektoren ist ein stabiler individueller DNA-Marker für jede transduzierte Zelle. Aus Leukozyten-DNA des Rhesusaffen wurden mehr als 80 Integrations-stellen durch ligationsmediierte PCRs identifiziert. Um aus dieser polyklonalen Population die Aktivität einzelner Stammzellklone direkt zu verfolgen, wurden klonspezifische PCR-Nachweise für vier Integrationsstellen etabliert. So konnte ein kontinuierlicher, langfristiger Beitrag individueller Stammzellklone zur Hämatopoese durch den Nachweis klonspezifischer DNA-Marker in kurzlebigen Granulozyten an 14 Zeitpunkten über 2 Jahre gezeigt werden. Zusätzlich wurden zwei dieser aus CD34+-Zellen hervorgegangenen Klone an mehreren Zeit-punkten simultan in hochreinen myeloischen und lymphatischen Zellpopulationen detektiert, sie haben folglich ihre Pluripotenz bewahrt. Ein weiterer langzeitaktiver Klon wurde nur in myeloischen Zellen gefunden, nicht jedoch in FACS-getrennten T- oder B-Zellen. Daher hat eine klonale Restriktion zur myeloischen Differenzierung stattgefunden oder es wurde ein myeloischer Progenitor transduziert. Jeder analysierte Klon steuerte 0,6-6% zur Gesamtgen-markierung bei, somit kann die Stammzellfrequenz im mobilisierten Blut des Rhesusaffen auf 2,5/107 mononukleäre Zellen geschätzt werden. Obwohl alle Klone langfristig stabil zur „steady state“ Hämatopoese beitrugen, wurde keiner der vier intensiv analysierten Klone früher als 6 Wochen nach der Transplantation detektiert. Vermutlich erfolgt die frühe Repopulation durch andere Zellgruppen wie vor kurzem entdeckten „Short Term Engraftern“.
Die Untersuchungsergebnisse erbrachten erstmalig den direkten molekularen Nachweis einer polyklonalen, pluripotenten und dauerhaften Hämatopoese durch individuelle Stammzellen in einem Großtiermodell. Kürzlich wurde die klinische Relevanz der vorgestellten Methoden zur Klonalitätsanalyse für künftige Stammzell- oder Gentherapien mit dem Nachweis einer Leukämieinduktion durch Insertionsmutagenese bei der SCID-X1 Gentherapie deutlich.


Kurzfassung in Englisch

Adult hematopoietic stem cells possess an enormous regenerative potential. The exact number of individual clones, activity patterns and their quantitative contribution to human or large animal hematopoiesis is unknown. It is also unclear whether the regenerative capacities of adult hematopoietic stem cells include cell types outside the hematopoietic system or if the recently reported plasticity of these cells is due to artefacts. Therefore, new methods for the molecular analysis of the in vivo activity of single stem cell clones are necessary.
Using a HeLa tumor cell model we developed highly sensitive methods allowing for the first time a direct quantitative clonal integration site analysis of individual gene marked stem cells in a complex genetic background. Then we analyzed the in vivo gene marked hematopoiesis in a rhesus macaque transplanted with retrovirally transduced CD34+ cells. The genomic integration site of retroviral vectors generates a stable unique DNA marker in every transduced cell. We identified more than 80 individual integration sites in the leukocyte DNA of the rhesus monkey by ligation-mediated PCR. To directly monitor the in vivo activity of individual clones within the polyclonal population we established clon-specific PCRs for four selected integration sites. The detection of clon-specific DNA markers in short-lived granulocytes at 14 different time points over a period of 2 years proves a continuous long-term contribution of individual stem cell clones to in vivo hematopoiesis. Two clones were simultaneously detected in highly purified myeloid as well as in lymphoid cell populations at several time points post transplantation, indicating that the transplanted CD34+ cells preserved their pluripotency. One additional long-term active clone was only found in myeloid cells but never in FACS-sorted B- and T-cells. This finding is probably caused by a clonal restriction of the transduced stem cell to myeloid differentiation or due to initial transduction of a myeloid progenitor. Each analyzed clone contributed 0.6-6% to overall gene marking, the stem cell frequency can therefore be estimated to 2.5/107 mononuclear cells in the mobilized rhesus monkey blood. Although all clones showed a stable long-term contribution to the steady state hematopoiesis, none of the four intensively studied clones was detected earlier than six weeks post transplantation. Probably the early repopulation is accomplished by different cell types - possibly by recently discovered “short term engrafter cells”.
Our results provide for the first time a direct molecular evidence for a long-term active contribution of individual adult blood stem cells to polyclonal and pluripotent hematopoiesis in a large animal model. The clinical relevance of the described clonal analysis methods for future stem cell and gene therapies has recently been underscored by their important contribution to discover the induction of leukemia by insertional mutagenesis in a human SCID-X1 gene therapy trial.


SWD-Schlagwörter: Periphere Stammzellentransplantation , Gentherapie , Hämatopoese
Freie Schlagwörter (deutsch): Pluripotenz , retrovirale Transduktion , Plastizität , Genmarkierung , LAM-PCR
Freie Schlagwörter (englisch): integration site analysis , molecular tracking , pluripotency , hematopoietic stem cells
Institut: Inst. für Molekulare Medizin und Zellforschung
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Medizin und Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Kalle, Christof von (Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.10.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 16.08.2004
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