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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-15405
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1540/


Schlipf, Sarah

Der Proapoptotische Faktor Bcl-Xs : Expression, subzelluläre Lokalisierung und Wirkung auf die mitochondriale Membranpermeabilität

The Proapoptotic Factor Bcl-Xs : expression, subcellular localization and function on the mitochondrial membrane permeability

Dokument1.pdf (1.319 KB) (md5sum: 4fa3c33b4c9e2cade272e23ab5cd6299)

Kurzfassung in Deutsch

Apoptose wird durch Mitglieder der Bcl-2 Familie reguliert. Man unterscheidet anti- und proapoptotische Proteine, wie z.B. Bcl-xS. Über die Funktion von Bcl-xS ist wenig bekannt, sogar seine physiologische Existenz wird immer noch kontrovers beurteilt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Vorkommen von endogenem Bcl-xS, seine Expression, Subzellulärlokalisierung und Wirkung auf die mitochondriale Membranpermeabilität untersucht. Die Existenz von endogenem Bcl-xS konnte nicht abschließend geklärt werden. Es konnte die für Bcl-xS kodierende mRNA mittels RT-PCR in manchen Zelltypen nachgewiesen werden. Der Nachweis von endogenem Bcl-xS auf Proteinebene gelang mittels Western-Blot-Analyse nicht, aber mittels Immunopräzipitation konnte ein Protein, bei dem es sich höchstwahrscheinlich um Bcl-xS handelt, in sehr geringer Menge nachgewiesen werden. So scheint Bcl-xS endogen nur in bestimmten Zellen und dort nur in sehr geringen Mengen vorzukommen. Es konnte sowohl mittels Subzellulärfraktionierung als auch für in-vitro transkribiertes/translatiertes Bcl-xS gezeigt werden, dass Bcl-xS ein integrales Protein der äusseren Mitochondrienmembran ist, dessen Interaktion mit dem Mitochondrium zumindest in-vitro proteinrezeptorunabhängig ist. Bcl-xS ist nicht in allen Zellarten zytotoxisch. Es gab gegen Bcl-xS-Überexpression „resistente“ Zellen, so z.B. HEK293- und HeLa-Zellen, andere Zellen hingegen waren Bcl-xS „sensitiv“, so z.B. R6-, MEF-bcl-x-/-- und PC12-Zellen. Diese Zellen gingen bei Überexpression von Bcl-xS apoptotisch zugrunde, konnten jedoch durch stabil überexprimiertes Bcl-2 geschützt werden. Des weiteren wurde analysiert, welche Domänen für die apoptotische Funktion von Bcl-xS wichtig sind. Es konnte gezeigt werden, dass die mitochondriale Lokalisation, die durch die Transmembranregion vermittelt wird, ein frühes und wichtiges Instrument des apoptotischen Effektes von Bcl-xS ist. Nach der Bcl-xS Translokalistion ans Mitochondrium ist seine BH3-Domäne und in geringerem Grad die Loop-Region nötig für die Fortsetzung der Apoptose. Ebenso wie zytosolisch lokalisiertes Flag-Bcl-xS verliert am ER und an der Kernmembran lokalisiertes Flag-Bcl-xS jegliche Zytotoxizität. Dadurch konnte bestätigt werden, dass die spezifische Insertion von Flag-Bcl-xS in die mitochondriale Membran für die apoptotische Funktion absolut unerlässlich ist und nicht durch eine Interaktion mit einer anderen Membran, wie z.B. der ER-Membran, ersetzt werden kann.


Kurzfassung in Englisch

Apoptosis is regulated by members of the Bcl-2-family. There are anti- and proapoptotic proteins, i.e. Bcl-xS. Little is known about the function of Bcl-xS even its physiological existence is still being discussed. In the present work, the presence of endogenous Bcl-xS, its subcellular localization und its function on the permeability of the mitochondrial membrane were analysed. The question whether endogenous Bcl-xS exists could not be finally answered. In some cell types, mRNA coding for Bcl-xS was found using RT-PCR. The proof of existing endogenous Bcl-xS on protein level was not successful using Western Blot analysis, but with Immunoprecipitation small amounts of a protein, most likely being Bcl-xS were identified. Thus, Bcl-xS seems to be present endogenously only in certain cell types and there only in small quantities. By means of subcellular fractions as well as by means of in vitro transcribed/translated Bcl-xS, Bcl-xS was shown to be an integral part of the mitochondrial outer membrane. This interaction with the mitochondrium is at least in vitro independent of a protein receptor. Bcl-xS is not in all cell types cytotoxic. There were against Bcl-xS-Overexpression “resistant” cells, other cells were “sensible” to Bcl-xS. In case of Bcl-xS-Overexpression, these cells underwent apoptosis, but were protected by stably transfected overexpressed Bcl-2. The domains of Bcl-xS were analysed regarding the apoptotic function of Bcl-xS. It was shown that the mitochondrial localization of Bcl-xS which is mediated by the trans membrane region is very important for the apoptotic effect of Bcl-xS. After being translocalized to the mitochondrium the BH3-domain of Bcl-xS and – to a lesser extent – the loop-region are necessary for the on-going of apoptosis. Cytosolic Flag-Bcl-xS loses all toxicity as well as on the ER and on the nuclear membrane localized Flag-Bcl-xS. This confirmed that the specific insertion of Flag-Bcl-xS into the mitochondrial membrane is crucial for the apoptotic function of Bcl-xS.


SWD-Schlagwörter: Apoptosis , Mitochondrienmembran , Immunoblot , Immunfluoreszenz , Polymerase-Kettenreaktion
Freie Schlagwörter (deutsch): Bcl-Xs , Bcl-2-Familie , In-Vitro-Transkription
Freie Schlagwörter (englisch): apoptosis , mitochondrial membrane , Bcl-Xs , Bcl-2-family
Institut: Inst. für Molekulare Medizin und Zellforschung
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Medizin und Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Borner, Christoph (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2004
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 09.12.2004
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