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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-15476
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1547/


Winkler, Karin

Durch Hochdruck-Homogenisation gewonnene Mistelpräparate : Charakterisierung der Membranvesikel und deren Wechselwirkung mit aktiven Inhaltsstoffen

Mistletoe extracts produced by high pressure homogenisation : characterisation of membrane vesicles and interaction with active drug substances

Dokument1.pdf (4.502 KB) (md5sum: 2d7df07d8a59c2671ff64743acebe964)

Kurzfassung in Deutsch

Wässrige Mistelextrakte werden seit mittlerweile über 80 Jahren in der Tumortherapie eingesetzt. Bei speziell hergestellten Mistelextrakten sind Membranvesikel enthalten, die ähnlich wie Liposomen aufgebaut sind. Liposomale Präparate finden in der Therapie Anwendung, weil durch sie das pharmakokinetische Verhalten von inkorporierten Wirkstoffen beeinflusst werden kann. Intravenös verabreichte liposomale Zytostatika-Präparate zeigen beispielsweise eine Akkumulation des Wirkstoffs im Tumor ("Drug targeting").
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von vesikulären Strukturen in Bezug auf die Größe und Menge der extrahierten Vesikel. Weiterhin wurden Interaktionsmöglichkeiten der Membransysteme mit anderen pflanzeneigenen Substanzen im Mistelextrakt untersucht.
Bei der Homogenisation von Pflanzenmaterial in wässrigem Medium nach dem Press-Spalt-Prinzip unter Gasausschluss wird das Zellgewebe intensiv aufgeschlossen und sehr effektiv in die Dispersion überführt. Membranen der Zellen und der Organellen werden durch die Scherkräfte zerrissen und formieren sich neu zu Membranvesikeln.
Der Nachweis dieser Vesikel sowohl in frischem Mistelextrakt als auch in einem auch dem Markt befindlichen Präparat gelang mit Hilfe der Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie ohne Fixierung. Es wurde eine Methode mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) entwickelt, um die Vesikel von den restlichen Bestandteilen des Mistelextraktes abzutrennen und ihrer Größe nach aufzutrennen. In den erhaltenen Fraktionen wurde eine Größenanalyse mit GPC und anschließender MALLS-Detektion (Multi angle laser light scattering) und Photonenkorrelationsspektroskopie durchgeführt. Alle Methoden zeigten vergleichbare Ergebnisse mit polydispersen multimodalen Verteilungen. Dabei liegen die Vesikelgrößen zwischen 50 und 250 nm.
Neben dem Nachweis der Vesikel und der Bestimmung der Größenverteilung wurde eine Methode entwickelt und gemäß den Richtlinien der ICH (International conference on harmonisation) validiert, um Phospholipide in wässrigen phosphathaltigen Mistelextrakten zu bestimmen. Phospholipide dienen als Leitsubstanz für extrahierte Vesikel aus dem Pflanzenmaterial. Es liegt eine organspezifische Verteilung der Phospholipide und eine je nach Organ variierende Extrahierbarkeit vor.
Interaktionsstudien von Vesikeln mit Viscotoxinen, Lektinen und Triterpenoiden zeigten, dass alle drei Substanzgruppen mit Vesikeln interagieren. Polysaccharide beeinflussen die Interaktion von Lektinen mit Vesikeln. Über Zentrifugationsexperimente konnte nachgewiesen werden, dass Viscotoxine an die vesikulären Membranen binden. Es wurde gezeigt, dass zwischen den Membranen und der umgebenden Lösung ein Gleichgewicht besteht. In dieser Arbeit konnte weiterhin belegt werden, dass im Mistelextrakt ein Teil der Lektine pH-abhängig an Vesikel gebunden vorliegt. Ebenso pH-abhängig treten Aggregationen der Vesikel bei Lektinzugabe auf. Im Mistelextrakt wurden Aggregationen jedoch nicht in diesem Umfang beobachtet, obwohl ausreichende Lektinkonzentrationen vorhanden sind. Aus der Pflanze stehen weitere Substanzen zur Verfügung, die bei der Herstellung des Extrakts im kolloidalen System eine Struktur ausbilden, welche die Vesikel vor einer massiven Ausflockung schützen. Polysaccharide könnten eine solche Funktion erfüllen. Sie sind fähig, sich auf die Oberfläche der Vesikel anzulagern, wie durch Inkubationsversuche mit Polysacchariden und Lektinen gezeigt werden konnte. Auch für Triterpenoide konnte eine Interaktion mit den Vesikeln belegt werden. Diese ist für die Triterpensäuren ebenfalls pH-abhängig. Dagegen zeigten die Wechselwirkungen mit Triterpenacetaten keine pH-Abhängigkeit.
Interaktionen zwischen Mistelinhaltsstoffen in wässrigen Mistelextrakten beeinflussen ein pharmazeutisches Präparat entscheidend in seiner Qualität. Die Vesikel spielen in diesem Wechselwirkungssystem eine bedeutende Rolle. Die Prozessführung bei der Herstellung beeinflusst die Ausbeute der verschiedenen Inhaltsstoffe, die Einbindung in das entstehende kolloidale System und die Stabilität. Die Auswahl der Pflanzenteile ebenso wie die Wahl der Bedingungen (z. B. pH-Wert) bei der Extraktion und im späteren Produkt können von entscheidender Bedeutung sein.


Kurzfassung in Englisch

Aqueous mistletoe extracts are used in tumour therapy since more than 80 years. Using a special homogenisation procedure, the extracts contain membrane vesicles, which are similar to liposomes. Liposomally entrapped drugs are used in therapy because the incorporation into the liposomes can modify the pharmacokinetics of a substance. For example, liposomally entrapped chemotherapeutic agents accumulate after intravenous injection in tumours ("drug targeting").
The presented thesis characterises vesicular structures with respect to size and quantity of the extracted vesicles. Furthermore, possible interactions of the membrane systems with other plant substances in aqueous mistletoe extracts are studied.
During the preparation of the plant extracts by a press-slit-technique in an aqueous medium with exclusion of oxygen, water-soluble substances are dissolved very effectively while other components can be dispersed. Membranes of cell walls and cell organelles of the plant material are disrupted by the high pressure and shear rate. Membrane fragments form liposome-like vesicles, which are then dispersed as colloids.
The visualisation of the vesicles was performed successful without any fixation by glutaraldehyde in freshly prepared mistletoe extracts as well as in a commercially available formulation, which is produced by a similar technique. A method was developed to isolate the vesicles from the mistletoe extract by gel permeation chromatography (GPC) and to separate them by size. The resulting fractions were analysed by GPC / MALLS (multi angle laser light scattering) and by photon correlation spectroscopy. All methods show comparable results with polydisperse multimodal distribution. The size of the vesicles varies from 50 to 250 nm.
In additon to the visualisation and the characterisation of the vesicle sizes, a quantification method was developed and validated according to ICH guidelines (International conference on harmonisation). Using this protocol phospholipids can be extracted from the phosphate containing extracts and are quantified. Phospholipids are used a marker substance for extracted membrane vesicles. A specific distribution for the plant organs and variable extraction efficiency depending on the material could be shown.
Interaction studies with vesicles and viscotoxins, mistletoe lectins and triterpenoids show the interaction potential of the membranes with these three substance groups. Polysaccharides influence the interactions between lectins and vesicles. Viscotoxins are able to bind to vesicular membranes and are centrifuged with them into the pellet. The binding is reversible. This thesis also describes a pH-dependent binding of lectins to the vesicles in mistletoe extracts. Isolated vesicles can aggregate after addition of lectins in a pH-dependent manner. Aggregation within the mistletoe extracts are not observed to this extent, although the concentration of lectins is high enough. Obviously the extracts contain substances which form colloidal structures protecting the vesicles against a precipitation process. Polysaccharides could fulfill such a function. They are able to interact with the surface of vesicles as proved by incubation experiments with vesicles, polysaccharides and lectins. In addition, triterpenoids interact with vesicles. Triterpene acids are integrated in a pH-dependent manner whereas triterpene acetates interact without any influence of pH.
Interactions between mistletoe components influence the quality of the aqueous extracts. Vesicles are important structures in these interaction systems.
The process parameters of the manufacturing procedure influence the efficiency of extraction of the different components, the binding characteristics to the colloidal system and the stability. The choice of plant organs as well as the settings (for example: pH) during extraction and later in the product can be of relevance.


SWD-Schlagwörter: Vesikel , Lectine , Viscotoxin , Triterpenoide , Lichtstreuung
Freie Schlagwörter (deutsch): Mistelextrakte , Viscum album L. , Vesikel , Interaktionen , MALLS
Freie Schlagwörter (englisch): Misteltoe extracts , Vesicles , Mistletoe lectins , Viscotoxins , Interactions
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schubert, Rolf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.11.2004
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 18.01.2005
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