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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-15515
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1551/


Treede, Irina

Aufklärung der Funktion von zwei rRNA-Methyltransferasen und Untersuchungen zur Eurekanat-Biosynthese in Streptomyces viridochromogenes Tü57

Functional evidence of the function of two rRNA methyltransferases and studies of the Eurekanate-biosynthesis in Streptomyces viridochromogenes Tü57

Dokument1.pdf (2.738 KB) (md5sum: 45f3c76005035fd43458cda1d600344c)

Kurzfassung in Deutsch

Avilamycine sind Orthosomycin-Antibiotika und werden von Streptomyces viridochromogenes Tü57 gebildet. Sie bestehen aus einem terminalen Dichloro-isoeverninsäure-Rest, der esterglykosidisch mit einer Heptasaccharidkette verknüpft ist, die aus zwei Molekülen D-Olivose, 2-Desoxy-D-Evalose, 4-O-Methyl-D-Fucose, 2,6-Di-O-Methyl-D-Mannose, L-Lyxose und Methyleurekanat zusammengesetzt ist. Avilamycine besitzen eine ausgezeichnete antibiotische Aktivität gegen grampositive und auch multiresistente Keime. Die Wirkung der Orthosomycine beruht auf einer Inhibierung der bakteriellen Proteinbiosynthese durch Bindung an die ribosomale 50S-Untereinheit. Zurzeit wird Avilamycin als Wachstumsförderer in der Tiermast eingesetzt, wodurch eine zunehmende Resistenzentwicklung gegenüber Avilamycin beobachtet wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass der Avilamycin-Produzent seine eigenen Ribosomen durch zwei AdoMet-abhängige Methyltransferasen schützt (AviRa und AviRb), die spezifische Nukleotide der 23S rRNA modifizieren. Verkürzte in-vitro-Transkripte der Domäne V der 23S rRNA dienten als Substrate für Methylierungsversuche mit beiden heterolog exprimierten rRNA-Methyl-transferasen. Durch Primer-Extension und MALDI-TOF-MS-Analytik konnten die genauen Zielstrukturen in der 23S rRNA für beide Enzyme identifiziert werden. AviRa ist eine N-Methyltransferase, die Position G2535 in Helix 91 der Domäne V methyliert, während AviRb die 2'-O-Ribose-Position des Nukleotides U2479 in Helix 89 methyliert. Keines dieser beiden Nukleotide wurde bisher als Target für eine enzymatische Methylierung beschrieben. Des Weiteren erfolgte die Funktionsaufklärung von vier an der Avilamycin-Biosynthese beteiligten Enzymen (aviB1, aviO1, aviO2 und aviO3), die durch einen Genaustausch inaktiviert wurden. Durch NMR-Analytik konnte die Beteiligung von AviB1 und AviO2 an der Biosynthese des Eurekanates, das zur wichtigen Klasse der "branched-chain"-Zucker gehört, eindeutig nachgewiesen werden. Der aus der Inaktivierung von aviO1 und aviO3 resultierende Zusammenbruch der Avilamycin-Produktion spiegelte die essentielle Funktion der beiden Gene für die Avilamycin-Biosynthese wider. Für weitergehende Untersuchungen in vitro wurden die drei Enzyme AviO2, AviB1 und AviB2, die an der Eurekanat-Bildung beteiligt sind, als GST-Fusionsproteine löslich exprimiert und aufgereinigt.


Kurzfassung in Englisch

Avilamycins belong to the orthosomycin class of antibiotics and are produced by Streptomyces viridochromogenes Tü57. Structural features common to members of orthosomycins are a terminal dichloroisoeverninic acid unit, several desoxysugars and an eurekanate moiety associated by a unique orthoester linkage. Avilamycins inhibit the growth of multi-drug-resistant Gram-positive bacteria. Avilamycin inhibits bacterial protein synthesis by binding to the 50S ribosomal subunit. Avilamycin is presently used as a growth promoter in animal feeding, which limits its clinical usefulness. In this study it has been shown that the ribosomes of the producer strain are protected from the drug by the action of two AdoMet-dependent rRNA methyltransferases (AviRa and AviRb) that target 23S rRNA. Recombinant AviRa and AviRb proteins retain their activity after purification, and both specifically methylate in vitro transcripts of 23S rRNA domain V. Reverse transcriptase primer extension indicated that AviRa is an N-methyltransferase that target G2535 within helix 91 of rRNA, whereas AviRb modified the 2'O-ribose position of nucleotide U2479 within helix 89. MALDI mass spectrometry confirmed the exact positions of each of these modifications,and additionally established that a single methyl group is added at each nucleotide. Neither of these two nucleotides have previously been described as a target for enzymatic methylation.
Furthermore the present work provides experimental proof for the function of two genes of the avilamycin biosynthetic gene cluster, aviB1 and aviO2, that are both involved in avilamycin structure modification. The function of both genes were identified by gene inactivation experiments and NMR analyses of extracts produced by the mutants. It is suggested that both AviO2 and AviB1 are involved in the biosynthesis of eurekanate, that belongs to the important class of branched-chain carbohydrates present in a wide variety of natural sources. Moreover, two other genes (aviO1 and aviO3) have been inactivated resulting in a breakdown of avilamycin production in both mutants ITO1 and ITO3, which clearly shows the essential role of both enzymes in avilamycin biosynthesis. The three enzymes AviO2, AviB1 und AviB2, that are all involved in the eurekanate biosynthesis, have been expressed in E.coli BL21 as GST-fusion proteins to purify the recombinant enzymes, that can be used for in vitro assays.


SWD-Schlagwörter: Methyltransferasen , Avilamycin , Antibiotikum / Arzneimittelresistenz , Proteinbiosynthese , Orthosomycine
Freie Schlagwörter (deutsch): Eurekanat-Biosynthese , Orthoester
Freie Schlagwörter (englisch): avilamycin , methyltransferases , orthosomycin antibiotics , antibiotic resistance , eurekanate
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, A. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.12.2004
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 22.12.2004
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