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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-15977
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1597/


Kindle, Karin

Erforschung des Beitrags des MAPK- und STAT-Signalwegs an der EGF-vermittelten Aktivierung der c-fos-Gen-Expression

Elucidation of the contribution of the MAPK and STAT signaling pathways towards the EGF-mediated activation of c-fos gene expression

Dokument1.pdf (17.962 KB) (md5sum: 11c5c127c946795c5b7bee41c289b658)

Kurzfassung in Deutsch

Das c-fos-Gen enthält eine Vielzahl regulatorischer DNA-Bindestellen in seiner Promotor-Region. Diese Promotor-Elemente sind entscheidend an der spezifischen Antwort zu verschiedenen Umweltreizen, denen Zellen im Körper ausgesetzt sind, beteiligt. Die Stärke der c-fos-Gen-Expression ist abhängig von den, in der Promotor-Region-gebundenen Transkriptionsfaktoren und der Interaktion mit anderen Faktoren im Zellkern. Die Fehlregulation dieses Gens ist mit der Entstehung von Knochenkrebs korreliert. Ein bekannter Stimulus der c-fos-Gen-Expression ist die Gabe von Epidermis-Wachstumsfaktor. Dieser bindet an den EGF-Rezeptor und durch diese Interaktion wird der äußere Reiz über verschiedene Signalwege in die Zelle übermittelt und in eine entsprechende Gen-Aktivierung umgesetzt. Der EGF-Rezeptor und das verwandte EGF-Rezeptor-Familien-Mitglied, der ErbB2-Rezeptor, werden in vielen verschiedenen Krebsarten überexprimiert oder zeigen häufig Aminosäure-Substitutionen, deren Bedeutung in der Tumorgenese durch epidemiologische Studien untermauert wurden.
In dieser Arbeit waren der Mitogen-Aktivierte-Protein-Kinase- (MAPK)- und der Signal-Transduzierer-und-Aktivatoren-der-Transkription-(STAT)-vermittelte Signal-weg von zentralem Interesse. Zu Beginn der Entdeckung von STAT-Proteinen wurde angenommen, dass diese lediglich durch Zytokine aktiviert wurden. Es zeigte sich jedoch später, dass auch Wachstumsfaktoren ihre Aktivierung verursachen konnten. Da es sich bei dem EGF-Rezeptor um ein Transmembran-Protein handelte, im Gegensatz zu den aus mehreren Untereinheiten-bestehenden Zytokin-Rezeptoren, wurde der EGF-Rezeptor als Modellbeispiel zur Untersuchung dieses Signalwegs gewählt. Die Untersuchungen wurden in immortalisierten, in Zellkultur-gehaltenen Zellen mit transfizierten Plasmiden, auf denen Reporter-Gene kodiert wurden und deren Expression über Promotorelemente des c-fos-Promotors gesteuert wurden, ausgeführt. Es war von Interesse, inwiefern Komponenten dieser beiden Signalwege miteinander in der EGF-vermittelten Reporter-Gen-Expression ko-operierten. Ich habe den Beitrag der durch diese beiden Signalwege nach EGF-Gabe aktivierten Transkriptionsfaktoren an der Expression von Reporter-Genen detailliert erforscht und konnte folgende Schlüsse ziehen:
-Faktoren, die an eine STAT-Bindestelle binden ko-operieren in der Aktivierung der Reporter-Gen-Expression nach Gabe von EGF mit Faktoren, die an eine SRE-Bindestelle binden.
- Das Ausmass der beobachteten Aktivierung der Reporter-Gen-Expression nach Gabe von EGF ist abhängig vom Abstand zwischen der STAT- und SRE-Bindestelle. Dies wurde schlüssig durch Verwenden verschiedener Reporter-Gen-Konstrukte gezeigt. Für diese wurden die STAT- und die SRE-Bindestelle in verschiedenen Abständen voneinander, aber im selben Abstand von der TATA-Box, in die Promotor-Region des Reporter-Gens kloniert.
-Der beobachtete synergistische Effekt, den Faktoren, die an die STAT-Bindestelle und an die SRE-Bindestelle in der Promotor-Region der Reporter-Gene binden, vermitteln ist nicht offensichtlich abhängig von der Orientierung der Bindestellen auf der DNA-Helix.
- Die Sequenz zwischen der STAT- und der SRE-Bindestelle hat keinen Einfluss in dem benutzten Reporter-System auf die EGF-vermittelte Aktivierung der Reporter-Gen-Aktivität.
- Es gibt keinen Unterschied in dem verwendeten Reporter-System bezüglich der EGF-vermittelten Aktivierung der Reporter-Gen-Aktivität beim Vergleich einer im c-fos-Promotor enthaltenen STAT-Bindestelle mit einer mutierten STAT-Bindestelle, die in Gel-elektrophoretischen Mobilitäts-Analysen eine erhöhte STAT-Binde-Affinität zeigt.
- Hingegen ermöglichten A431-Zellextrakte von unbehandelten oder induzierten Zellen zumindest zum Teil die Charakterisierung der Proteinkomplexe, die sich in der Promotor-Region des Reporter-Gens ausbilden, bei dem die STAT- und die SRE-Bindestelle einen Abstand von 9 bp haben. In diesem Fall konnte eindeutig gezeigt werden, dass STAT- und TCF-Proteine in ihrer Beteiligung am gebildeten Multi-Protein-Komplex auf dem Promotor konkurrieren. Vermutlich können beide aus sterischen Gründen nicht binden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass diese Konkurrenz bei einem Promotor, in dem die STAT- und die SRE-Bindestelle 18 bp auseinander liegen, nicht besteht.


Kurzfassung in Englisch

The c-fos promoter contains a complex array of regulatory DNA sequences. These elements are essential for the tissue-specific regulation of c-fos expression in response to a variety of signal transduction pathways. The responses to different signals are therefore likely to be determined by the quota of transcription factors and cofactors bound at the c-fos promoter in a given cell. The aim of this study was to provide a better understanding of c-fos activation in response to extracellular stimuli, and the promoter sequences governing these responses. Epidermal growth factor (EGF) is one example of a signalling molecule that regulates c-fos gene expression. Binding of EGF to its receptor (EGFR) in the plasma membrane activates intracellular signalling pathways resulting in the activation of a network of target genes, including c-fos . The Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) and Signal Transducers and Activators of Transcription (STAT) signalling pathways are both known to be involved in mediating EGF signals, and both have been shown to activate c-fos expression. Unlike more complex multi-subunit cytokine receptors, EGFR functions as a single transmembrane protein and we therefore focused on this model of c-fos activation, via EGF stimulation of MAPK and STAT signalling pathways.
The genes encoding EGFR and the related ErbB2 receptor, have been shown to be over-expressed or mutated in several types of cancer. Epidemiological studies have identified amino acids substitutions in EGFR and ErbB2 associated with tumorigenesis.
Misregulated c-fos expression correlates with the development of cancer of the bone.
A series of experiments were performed to determine the importance of different c-fos promoter elements for the response to EGF. Immortalised cell lines were transiently transfected with expression plasmids for EGFR or derivatives thereof, and with reporter-genes under the control of c-fos promoter sequences. Reporter activation in response to EGF was determined. The contribution of specific promoter element such as the STAT binding site (SIE) and Serum response element (SREs) to the EGF-induced gene expression was determined by mutagenesis and deletion analysis. The major findings of this study are as follows:
- Cooperative activation was observed in the presence of functional SRE and STAT sites. This indicates that EGF responses are enhanced through synergistic /co-operativity of factors bound to the SRE and STAT binding sites
- The extent of reporter activation after EGF stimulation is dependent on the spacing between the STAT binding sites and SRE.
-The synergistic effect of SIE- and SRE-bound factors is not apparently dependent on the orientation of the binding sites on the same or either site of the DNA-helix
- The sequence between the STAT-DNA and SRE-DNA appears to be unimportant as altering this did not affect the observed c-fos activation in response to EGF,
-A synthetic STAT-DNA behaves comparably in reporter assays to the STAT binding site found in the c-fos promoter region.
- The use of cell extracts from A431 cells in EMSA studies allowed the characterisation of protein complexes formed at the promoter region of reporter genes, where the STAT-DNA and SRE-DNA are 9 bp apart from each other. It was shown unambiguously that binding of STAT proteins to the promoter prevented TCFs from binding to the same region in the promoter and vice versa. This competition for binding between these two factors is no longer apparent when the STAT-DNA and SRE-DNA show a spacing of 18 bp.


SWD-Schlagwörter: Fos , Epidermaler Wachstumsfaktor , Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor , STAT , Serum Response Factor
Freie Schlagwörter (englisch): c-fos , epidermal growth factor , gene expression , sis-inducible element , serum response element
Institut: Institut für Biologie 3
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Sippel, Albrecht E. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.01.2005
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 20.01.2005
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