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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-16039
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1603/


Reisinger, Ellen

Identifizierung und Charakterisierung entwicklungsabhängig hochregulierter Gene im Innenohr der Ratte

Identification and characterization of development dependent upregulated genes in the inner ear of the rat

Dokument1.pdf (4.216 KB) (md5sum: aa8183de9f2fe22b69c4f40705b71004)

Kurzfassung in Deutsch

Durch die außergewöhnlichen Sinnesleistungen benötigt das Säugetiergehör eine Vielzahl spezifischer Proteine. Bislang ist nur ein Teil dieser Proteine bekannt und in ihrer Funktion für das Innenohr beschrieben worden.
In dieser Arbeit wurden Gene identifiziert, die während der postnatalen Entwicklung des sensorischen Epithels im Innenohr der Ratte hochreguliert waren. In einem 'Differential Display' Experiment wurden 174 verschiedene Gene gefunden, die im Corti'schen Organ kurz nach dem Beginn der Hörfähigkeit höher exprimiert waren als am Tag der Geburt. Ca. 60% der identifizierten Transkripte codieren für Proteine bekannter Funktion. Diese gehörten allen funktionellen Kategorien an: Neben Proteinen, die in der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt waren, erwiesen sich u. a. Transkriptions- und Translationsfaktoren, Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, Zelladhäsionsmoleküle, Komponenten des Cytoskeletts und eine Reihe synaptischer oder vesikulärer Proteine als entwicklungsabhängig hochreguliert. Neben den Proteinen bekannter Funktion waren hypothetische Proteine und nicht näher charakterisierte mRNAs unter den differentiell exprimierten Genen. Die Hochregulation von Transkripten aus dem 'Differential Display&' wurde stichprobenartig mit quantitativer Real-Time PCR überprüft. Dabei erwiesen sich 93% der mRNAs als hochreguliert.
Mit 296 Banden war eine erhebliche Anzahl an differentiellen Banden im 'Differential Display' identifiziert worden, jedoch waren darunter lediglich 174 verschiedene Transkripte. Durch eine genaue Analyse des Verlaufs der Redundanz konnte ein statistisches Modell aufgestellt werden, welches ein 'Differential Display' Experiment zu beschreiben vermochte. Dieses Modell erlaubt weiterhin eine Vorhersage über die nicht-redundanten Sequenzen, die mit einem beliebig erweiterten 'Differential Display' Experiment erhalten worden wären. Das statistische Modell sagt voraus, dass insgesamt 445 verschiedene differentiell exprimierte Gene aus ca. 2800 amplifizierbaren cDNAs der Corti-Organ-Präparationen theoretisch erhältlich sind, und dass 117 bis 145 Primerkombinationen für die Entschlüsselung von 90% der differentiell exprimierten Gene ausreichen.
Des Weiteren wurde ein neues Gen, das ebenfalls entwicklungsabhängig im Corti-Organ exprimiert ist, beschrieben. Dieses Cod106 genannte Protein ist ein membranassoziiertes Protein mit 106 kDa, das keine Ähnlichkeiten zu Proteinen bekannter Funktion aufwies. Durch in situ Hybridisierung konnte gezeigt werden, dass Cod106 in den auditorischen und vestibulären Haarzellen sowie in bestimmten Neuronen des Zentralen Nervensystems exprimiert ist. Immunhistochemisch konnte Cod106 an den synaptischen Polen der sensorischen Haarzellen der Cochlea und des Vestibularorgans lokalisiert werden. In kulitivierten Hippocampusneuronen war Cod106 mit dem postsynaptischen Markerprotein PSD95 kolokalisiert, wodurch auf eine eindeutig postsynaptische Lokalisation von Cod106 geschlossen werden kann. Das zellspezifische Expressionsmuster und die subzelluläre Lokalisation dieses Proteins wären mit einer spezifischen Funktion in postsynaptischen Prozessen vereinbar.


Kurzfassung in Englisch

The exquisite performance of the highly specialized mammalian inner ear requires a multitude of specific proteins. Yet, only a subset of these proteins has been identified and studied in detail.
The aim of this study was the identification of genes involved in the maturation of the organ of Corti. An mRNA differential display revealed 174 different genes with a higher expression level short after the onset of hearing than at birth. 60% of these transcripts code for proteins of known function, the remaining either encode proteins of unknown function or predicted proteins or were assigned to uncharacterized expressed sequence tags. The proteins of known function serve most different cellular functions including intracellular signaling pathways, control of growth and differentiation and regulation of protein biosynthesis and degradation. Furthermore, a number of synaptic or vesicular proteins as well as ion channels an cytoskeletal proteins were shown to be upregulated. These results give insight into the various molecular processes required for the onset of hearing. Furthermore, it seems suggestive that at least some of the uncharacterized proteins or mRNAs might be candidates for deafness genes.
Samples of the identified genes were tested for upregulation using a quantitative Real-Time-PCR approach. With this method, 93% of the transcripts could be confirmed as upregulated during inner ear maturation.
174 different genes were found in 296 differential display bands, due to a redundant amplification of genes with different primer combinations. By analyzing this redundancy, a statistical model describing differential display experiments was established. This model predicted that 445 different differentially expressed genes are theoretically available with this approach, and 2800 amplificable cDNA transcripts are expressed in total in the inner ear. Furthermore, the model predicted that 117 to 145 PCRs with different primer combinations serve to cover 90% of the expressed genes.
Beyond this differential display, a novel gene was described sharing the development dependent upregulation in the rat inner ear. The new protein, termed Cod106, is a membrane associated protein of 106 kDa that lacks sequence homology to characterized gene products. As shown by in situ hybridization, it is expressed in auditory and vestibular hair cells, as well as in distinct sets of CNS neurons with particularly high abundance in hippocampus and cerebellum. Immunohistochemistry detected Cod106 at the basal, synaptic pole of cochlear outer hair cells and vestibular hair cells. In cultured hippocampal neurons, Cod106 immunofluorescence co-localized with the postsynaptic density protein 95 (PSD95), indicating a postsynaptic localization. Cell-type specificity and subcellular localization may be consistent with an involvement of Cod106 in synaptic processes.


SWD-Schlagwörter: Differentielle Genexpression , Postnatale Entwicklung , Corti-Organ , Molekularbiologie , Postsynaptische Membran , Innenohrschwerhörigkeit , Innenohr
Freie Schlagwörter (deutsch): Haarzelle , Molekularbiologische Methoden , Cod106 , statistisches Modell des Differential Display
Freie Schlagwörter (englisch): hair cell , molecular biology methods , Cod106 , statistical model of the differential display
Institut: Physiologisches Inst. II
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Fakler, Bernd (Prof Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.02.2005
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 10.02.2005
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