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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-16270
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1627/


Steenpaß, Thomas

PEGylierte Sterole zur Funktionalisierung liposomaler Oberflächen

Pegylated sterols for functionalization of liposomal surfaces

Dokument1.pdf (4.723 KB) (md5sum: 0d7c5e34a75bb7104371ff6332dce857)

Kurzfassung in Deutsch

Die Entwicklung intelligenter Arnzeistoffträgersysteme, die in der Lage sind Wirkstoffe gezielt an den Wirkort zu transportieren, soll zu effizienteren und verträglicheren Therapieformen führen. Eine Möglichkeit, diesem Ziel näher zu kommen, stellt die Oberflächenmodifikation liposomaler Zubereitungen mit spezifisch auf eine Zieldeterminante ausgerichteten Vektoren dar.
Die fortschreitende Entwicklung von chimären und humanisierten Antikörpern, die Zelloberflächen-Epitope pathologisch veränderter Gewebe als therapeutisches oder diagnostisches Ziel nutzen, bietet eine Reihe neuer Liganden, die zur Funktionalisierung von Liposomen genutzt werden können.
Die Substanzen, die derzeit für die Kopplung von Liganden an liposomale Oberflächen zur Verfügung stehen, bedingen aufwendige und nicht universell einsetzbare Kopplungsprozeduren. Von besonderem Interesse ist die Modifikation von präformulierten, therapeutisch genutzten liposomalen Zubereitungen (z.B. Doxil®), da so auf einfache Weise ein bereits etabliertes System eine aktive Zielausrichtung erfahren könnte.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte herausgearbeitet werden, ob chemisch-aktivierte, ethoxylierte Sterole eine Alternative zu den konventionellen Membranankern darstellen, die heute zur Funktionalisierung liposomaler Zubereitungen genutzt werden. Zunächst wurde die Einlagerung der PEGylierten Sterole in Vesikel unterschiedlicher Membrankomposition untersucht. Die Transferaten lagen in Abhängigkeit der Membrankomposition zwischen 90 und 30 % des angebotenen Materials und resultierten in einem PEG-Lipidanteil der Membran zwischen 6,75 und 2,4 mol%. Die über quantitative 1H NMR verfolgte Einlagerung der PEG-Sterole war innerhalb von 15 min abgeschlossen. Aus der Einlagerung resultierende Membrandefekte waren vorübergehender Natur und führten unter- und oberhalb der kritischen Mizellbildungskonzentration zu einer maximalen 8%igen Freisetzung eines verkapselten Fluoreszenzmarkers. Mikrokalorimetrische Untersuchungen lieferten einen hohen lipidnormierten Verteilungskoeffizienten von ca. 60 000 mol-1, was auf eine stabile Verankerung in der Membran hindeutet.
Es wurden zwei verschiedene, aminoreaktive Derivate (ein Tresylat-aktiviertes und ein N-Hydroxysuccinimid-aktiviertes) synthetisiert und charakterisiert, die zur Fixierung von Proteinen an der Liposomenoberfläche genutzt werden sollten
Die Untersuchung der Eignung der aktivierten, PEGylierten Sterole zur Kopplung von Liganden erfolgten anhand des Modellproteins Rinderserumalbumin u.a. in Abhängigkeit von der Konzentration des Proteins, des pH-Werts und der Lipidkomposition der Liposomen. Auf diese Weise konnte ein einfaches Zwei-Schritt-Protokoll erarbeitet werden, das eine hohe Ligandendichte an der Oberfläche der Liposomen garantiert. Das Verfahren erlaubt die nachträgliche Funktionalisierung von fluiden und rigiden liposomalen Oberflächen bei Raumtemperatur. Es unterschiedet sich so von publizierten Verfahren, die unter erhöhten Temperaturen (60°C) teilweise nur unzureichende Ligandendichten auf der Oberfläche ermöglichen.


Kurzfassung in Englisch

The design of intelligent drug carrier systems capable of site specific drug delivery is aimed on the development of more efficient and more compliant therapies. A possibility to achieve this goal is the modification of liposomal surfaces by attachment of ligands specifically interacting with markers which are characteristic for the pathologically altered tissue to be treated.
The progress in biotechnology which provides an increasing number of chimeric or humanized antibodies interacting with surface antigens offers more and more promising ligands mainly in the oncological field. One powerful approach for the manufacturing of targeted drug carrier systems is the subsequent modification of therapeutically established liposomal formulations (e.g. Doxil®). The molecules and mechanisms suitable for the attachment of ligands on liposomal surfaces is investigated extensively for nearly 30 years now. Nevertheless most of the coupling techniques described in literature are still unsatisfactory by means of coupling efficiency, flexibility of the coupling process and the practicability of the experimental setup. For instance subsequent modification of preformed (sterically stabilized) liposomes can not be guaranteed without elevating the temperature to 60 °C during the coupling procedure.
The main focus of the present work was the investigation of the suitability of pegylated sterols for the functionalization of liposomal membranes. Chemically activated derivatives (Tresyl and N-Hydroxysuccinimid derivatives) of these molecules were synthesized and used for the coupling of the model protein BSA to liposomes representing fluid, rigid an sterically stabilized membranes. The insertion of the derivatives into different phospholipid vesicles was assayed by 1H-NMR. Membrane damages during the incorporation process were followed using fluorescence dequenching, the partition coefficient of the sterol-PEGs was calculated by means of isothermal titration calorimetry. Coupling efficiency was examined as a function of time, pH, protein and sterol concentration and the lipid composition by liquid scintillation counting after separation of uncoupled and coupled BSA by size exclusion chromatography and free flow electrophoresis. Photon correlation spectroscopy was used to monitor the shift of the particle size distribution of the individual preparations.
A simple two step coupling protocol was established and optimized allowing the attachment of proteins to preformed liposomes by the usage of chemically activated PEGylated sterols.


SWD-Schlagwörter: Polyethylenglykolderivate , Coated vesicle , Coupling-Methode argeted drug delivery , Liposom
Freie Schlagwörter (deutsch): Sterische Stabilisierung , PEGylierung , PEG-Sterole
Freie Schlagwörter (englisch): stealth liposomes , protein attachment , post insertion technique
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schubert, Rolf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.07.2004
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 08.02.2005
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