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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-16422
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1642/

Haug, Gerd

"Clostridium botulinum" C2-Toxin: Interaktion der Toxinkomponenten und Translokation der Enzymkomponente in das Zytosol von Zielzellen

"Clostridium botulinum" C2 toxin: interaction of toxin components and translocation of the enzyme component into the cytosol of target cells

Kurzfassung in Deutsch

Das C2-Toxin von Clostridium botulinum ist der Prototyp der Familie der binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine. Es besteht aus der Bindungs-/Translokationskomponente C2II (80,5 kDa) und der Enzymkomponente C2I (49,4 kDa). Nach proteolytischer Aktivierung bildet das aktivierte C2IIa (~60 kDa) Heptamere, bindet an seinen zellulären Rezeptor und vermittelt die Translokation des C2I-Proteins aus den Endosomen in das Zytosol der Zielzellen. Der Translokationsschritt geht einher mit der Bildung von Poren, die durch Insertion der C2IIa-Heptamere in die Membran der Endosomen hervorgerufen werden. Das C2I-Protein wird dabei wahrscheinlich direkt durch diese Pore, deren innerer Durchmesser jedoch sehr klein ist (~2-4 nm), transportiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Interaktion von C2IIa mit C2I in vitro untersucht. Durch native Gelelektrophorese konnte eine spezifische Komplexbildung der Proteine C2I und C2IIa unabhängig vom Rezeptor nachgewiesen werden. Radioaktiv markiertes 125I-C2I-Protein war biologisch aktiv und zeigte im nativen Gel nach Vorinkubation mit C2IIa-Protein, nicht jedoch nach Vorinkubation mit inaktivem C2II, eine Änderung im Laufverhalten. Es konnte eine Komigration und somit ein Komplex mit dem C2IIa-Protein nachgewiesen werden. Titrationsexperimente deuten auf eine Interaktion von 3 Molekülen 125I-C2I mit einem C2IIa-Heptamer hin. Der Komplex (C2I/C2IIa) war zytotoxisch aktiv und zeigte im Vergleich mit der Gabe von Einzelkomponenten eine größere zytotoxische Aktivität.
Mit Hilfe eines Fusionstoxins aus C2I und Dihydrofolatreduktase (C2I-DHFR) wurde die Entfaltung des C2I-Proteins während des Translokationsschritts aus Endosomen in das Zytosol der Zielzellen untersucht. Das Fusionstoxin war biologisch aktiv. Methotrexat (MTX), ein Substratanalogon der Dihydrofolatreduktase, interagierte spezifisch mit der DHFR-Domäne des Moleküls. Es schützte das Fusionstoxin vor dem Abbau durch Trypsin und stabilisierte die Struktur des Fusionstoxins. MTX verzögerte die Vergiftung von Vero-Zellen mit C2I-DHFR/C2IIa nicht jedoch die mit C2I/C2IIa. Der MTX-Effekt beruhte daher wahrscheinlich auf einer spezifischen Interaktion mit der DHFR-Domäne. Es konnte ein Einfluss von MTX auf Endozytoseprozesse, auf die Zellbindung von C2I-DHFR sowie auf die ADP-Ribosylierung von Aktin in vitro ausgeschlossen werden. Darüber hinaus blockierte MTX die direkte C2IIa-vermittelte Translokation des C2I-DHFR über die Plasmamembran in das Zytosol, die durch pH-Erniedrigung induziert wurde. Dies spricht dafür, dass MTX die Entfaltung des C2I-DHFR-Proteins während der Translokation aus sauren Endosomen in das Zytosol verhindert.
Eine Beteiligung des Chaperons Hsp90 bei der Translokation wurde mit Hilfe der spezifischen zellgängigen Hsp90-Inhibitoren Geldanamycin und Radicicol gezeigt. Geldanamycin und Radicicol verzögerten die Vergiftung von Vero-Zellen durch C2-Toxin und schützten das zelluläre Aktin vor ADP-Ribosylierung. Die Inhibitoren hatten keinen Einfluss auf die ADP-Ribosylierung von Aktin in vitro. Sie beeinflussten weder die Bindung eines mit Alexa-488 markierten C2-Toxins noch Endozytoseprozesse. Geldanamycin verzögerte die direkte C2IIa-vermittelte Translokation von C2-Toxin über die Plasmamembran bei saurem pH-Wert. Die Immunfärbung des C2I in Ratten-Astrozyten zeigte, dass in Anwesenheit von Geldanamycin weniger C2I das Zytosol erreicht. Durch Kolokalisation mit Rab5 konnte bestätigt werden, dass C2I in den Endosomen verbleibt. Radicicol verzögerte außerdem die Vergiftung von Vero-Zellen durch C. perfringens Iota-Toxin und durch C. difficile CDT, zwei weitere binäre Aktin-ADP-ribosylierende Toxine. Die Befunde weisen darauf hin, dass alle Vertreter der binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine einen gemeinsamen Translokationsmechanismus haben und dieser Prozess Hsp90-abhängig ist.
Als Voraussetzung für weitere Untersuchungen über die Rolle und Bedeutung zytosolischer Faktoren wurde eine Gradientenauftrennung von Zellorganellen etabliert.

Kurzfassung in Englisch

Clostridium botulinum C2 toxin belongs to the family of binary actin ADP-ribosylating toxins. It consists of the binding/translocation component C2II (80.5 kDa) and the enzyme component C2I (49.4 kDa). After proteolytic activation, C2IIa (~60 kDa) forms heptamers, binds to its cellular receptor and mediates the translocation of C2I from acidic endosomes into the cytosol of target cells. The translocation step is accompanied by a pore formation of C2IIa in the endosomal membrane induced by acidic pH. The C2I protein is probably transported through this pore which has an inner diameter of about 2-4 nm.
The interaction of C2I and C2IIa independent of the cellular receptor was studied. A complex of C2I and C2IIa was detected by native gel electrophoresis. Radioactively labelled 125I-C2I showed a change in migration behaviour when preincubated together with C2IIa but not with C2II. A co-migration of C2IIa and 125I-C2I could be detected. Titration experiments indicate a 3:1 complex of 125I-C2I and C2IIa-heptamers. The complex (C2I/C2IIa) was biologically active and showed higher cytotoxic activity compared to the individual components.
A fusion toxin of C2I and dihydrofolate reductase (C2I-DHFR) was used to study unfolding of C2I during the translocation step from acidic endosomes into the cytosol. Methotrexate, a substrate analogue of dihydrofolate reductase, protected C2I-DHFR from tryptic degradation. Methotrexate delayed the intoxication of Vero cells with a combination of C2IIa and C2I-DHFR but not C2I and C2IIa. This argues for a specific interaction of methotrexate with the dihydrofolate reductase domain of the fusion toxin. Methotrexate had no influence on cell binding of C2I-DHFR, endocytosis or ADP-ribosylation of actin in vitro. However, methotrexate was able to block the direct C2IIa-mediated translocation of C2I-DHFR across the plasma membrane into the cytosol induced by extracellular acidic pH. Methotrexate obviously prevents unfolding of C2I-DHFR during translocation from acidic endosomes into the cytosol of target cells.
The role of the cellular chaperone hsp90 in the translocation process was studied with specific hsp90 inhibitors, namely geldanamycin and radicicol. Both substances delayed intoxication of Vero cells with C2 toxin and protected cellular actin from ADP-ribosylation by C2I. The inhibitors had no influence on the in vitro ADP-ribosylation of actin. An influence of the inhibitors on cell binding or endocytic processes was excluded. Geldanamycin delayed the C2IIa-mediated translocation of C2I across the cellular membrane at acidic pH. Immunostaining of C2I revealed that less C2I reached the cytosol of cells in the presence of the inhibitor. Co-localisation with the endosomal marker protein rab5 showed that C2I remained trapped in endosomes. In addition, radicicol delayed the intoxication of Vero cells with Clostridium perfringens iota toxin and Clostridium difficile transferase, two other members of the binary actin ADP-ribosylating toxins. The results suggest that all members of this toxin family share a common hsp90-dependent translocation mechanism.