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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-16440
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1644/


Tauber, Philipp

Liposomen als Modelle zur Messung von Wirkstoff/Membran-Wechselwirkungen

Liposomes as models for the characterization of drug/membrane interactions

Dokument1.pdf (7.836 KB) (md5sum: 2ed3c69084d3ec01b1ba62072b222711)

Kurzfassung in Deutsch

Membranen sind für die Pharmazeutische Forschung nicht nur als Targetstrukturen, sondern auch als biologische Barrieren von besonderem Interesse. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit Zellmembranen eigenen sich besonders Liposomen als einfache Modelle, um biologische Membranen zu imitieren und verschiedene Vorgänge, die in und an Membranen stattfinden näher untersuchen zu können. Dabei steht die Messung der Wirkstoffpermeation bzw. die Verteilung von Substanzen zwischen Membranen und wässriger Phase und deren Einfluss auf die Membraneigenschaften im Vordergrund. Die Verfahren zur Quantifizierung des Bindungsverhaltens von Stoffen an Liposomen lassen sich in direkte und indirekte-Methoden einteilen.

Bei den direkten Methoden wird der liposomal gebundene Wirkstoff von freiem mittels z.B. Ultrazentrifugation oder Gleichgewichtsdialyse abgetrennt und anschließend quantifiziert. In der vorliegenden Arbeit konnte das Bindungsverhalten des Wirkstoffs BIII 890 CL (Boehringer Ingelheim Pharma KG) an liposomale Membranen aus Soja-Lecithin mit einer direkten Bestimmungsmethode quantifiziert werden. Dabei wurde eine relativ schwache Anreicherung der Substanz an bzw. in die liposomale Membran festgestellt.

Die indirekten Verfahren quantifizieren die Änderung von Eigenschaften des Wirkstoffes bzw. der Liposomenmembran nach Bindung. Ein viel versprechender Ansatz in diesem Zusammenhang ist die Verwendung eines membrangebundenen Fluoreszenzmarkers, dessen spektrale Eigenschaften den Zustand der Membran widerspiegeln und somit genutzt werden können, um das Bindungsverhalten einer Substanz an die Membran zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Fluoreszenz-Assay entwickelt um die Wechselwirkungen zwischen Membranen und dem Gallensalz Natrium-Cholat (NaC) näher zu untersuchen. Mit Hilfe eines potentiometrischen Titrationverfahrens im "Lipophilie-Referenzsystem" Octanol/Wasser konnte in Voruntersuchungen festgestellt werden, dass die Lipophilie und damit das Verteilungsverhalten von NaC zwischen beiden Phasen, in besonderem Maße vom Ionisationsgrad und somit direkt durch den Umgebungs-pH beeinflusst wird. Daher wurde in darauf folgenden Experimenten besonderes Augenmerk auf den Einfluss des Ionisationsgrads, bei unterschiedlichen pH-Werten, während der Gallensalz-Lipid (Membran)-Interaktionen gelegt.

Der Fluoreszenzfarbstoff Laurdan ist aufgrund seiner besonderen chemischen Struktur in der Lage, in Abhängigkeit von der Umgebungspolarität, nach Lichtabsorption zwei verschiedene Anregungszustände auszubilden. Diese beiden Zustände unterscheiden sich durch die Lage und Intensität des Emissionsmaximums. Emissionsspektren von liposomal gebundenem Laurdan zeichnen sich durch eine Schulter und ein charakteristisches Fluoreszenzintensitätsmaximum aus. Um den Zustand einer Laurdan markierten Membran genauer charakterisieren zu können wurde ein Membranzustandsparameter (membrane state parameter, MSP) eingeführt, der temperaturabhängig einem Membranzustand einen Zahlenwert zuordnet. Die Berechnung dieses Fluoreszenzparameters erfolgt über Bildung des Verhältnisses der Fluoreszenzintensitäten bei den zwei Emissionswellenlängen.
Natrium-Cholat beeinflusst nach Bindung an die Liposomenmembran die Umgebung der Fluoreszenzsonde, wodurch sich die Fluoreszenzintensitäten bei den beiden Wellenlängen ändern. In Abhängigkeit von der eingesetzten Gallensalzkonzentration konnten Veränderungen des MSP beobachtet werden und über ein hier entwickeltes Auswertungsschema das Bindungsverhalten von NaC bei verschiedenen pH-Werten charakterisiert werden. Dabei wurde eine unterschiedliche Beeinflussung des MSP bei verschiedenen pH-Werten festgestellt. Insbesondere ungeladene, neutrale NaC-Moleküle, die sich durch eine hohe Lipophilie auszeichnen können tiefer in die Membran eindringen und dadurch die spektralen Eigenschaften der Fluoreszenzsonde stärker beeinflussen.
Mit Hilfe der indirekten Fluoreszenzmethode konnte für die Bindung von NaC an eine liposomale Membran eindeutig eine Zuordnung in eine initiale Verteilung an die detergensarme Membran im niedrigen Konzentrationsbereich und die anschließende Verteilung von Cholat zwischen der gemischten Lipid/Cholat-Membran und Puffer getroffen werden. Die Bindungsaffinität der Gallensalzmoleküle an Mischvesikel nimmt bei zunehmender Konzentration ab.

Anders als bei den direkten Methoden, bei denen lediglich der gebundene und freie, nicht gebundene Anteil eines Wirkstoffs bestimmt wird, ist mit diesem indirekten Verfahren zusätzlich die Unterscheidung zwischen einer oberflächlichen Anlagerung und einer tiefen Membranbindung möglich.


Kurzfassung in Englisch

An important field in modern biopharmaceutical research is the investigation of drug-membrane interactions, because most drugs encounter biological membranes at some point in their interaction with organisms, before reach the ultimate metabolic target. On the other hand, the lipid membrane may also represent the actual target for the drug. Therefore, to mimic cellular membranes relatively simple test systems are needed such as the phospholipid bilayers of liposomes.
Several tools and methods are available to perform binding studies, which characterize the partitioning of drugs into liposomes or which allow to examine the process of transformation of lamellar into micellar structures induced by detergents. Direct methods quantify the bound and free drug concentration after a separation step if the mixed aggregates from the aqueous medium, which is rather difficult. Additionally it is necessary to have a suitable assay for the particular compound of interest.
In this work the binding behaviour of the substance BIII 890 Cl (Boehringer Ingelheim Pharma KG) to liposomal membranes (consist of soy bean phosphatidylcholine) could be quantified with a direct method and a low enrichment of the substance in the membrane was found.
Indirect methods, which detect a change or a variation of a property of the substance or the liposomal membrane after binding, offer the advantage that no phase separation or specific drug detection is needed. The fluorescent dye laurdan (6-lauryl-2-dimethylamino-naphtalene), which can be incorporated at the hydrophilic-hydrophobic interface of phospholipid bilayers, reflects a characteristic membrane state by spectral changes in its fluorescence emission correlating with the polarity of the environment. Therefore it can be used as an optical sensor for monitoring of detergent partitioning into liposomes. In this work the sensitivity of laurdan as an indirect indicator for membrane disorder induced by the ionic detergent sodium cholate was investigated.
In preliminary studies the lipophilicity of the bile salt sodium cholate, characterized by the octanol/water partition coefficient (log P), in dependence of the pH-value was analyzed by a potentiometric titration approach. The lipophilicity and membrane binding strongly could be correlated with the degree of ionization of cholic acid.
In pure SPC-vesicles, the Laurdan emission spectrum is asymmetrical and characterized by a maximum at 486 nm and a shoulder at 434 nm. The fluorescence emission at these wavelengths, refer to two different states of molecular excitation, a so called locally excited (LE) and a charge transfer state (CT) The ratio of the intensities at these two wavelengths was be used as a "membrane-state-parameter&" (MSP).
The addition of the bile salt sodium cholate to Laurdan labelled liposomes leads to changes in the MSP in a concentration-dependent manner. This effect was increased with decreasing pH. In particular, uncharged species of cholate molecules, which are highly lipophilic seem to penetrate deeper into the membrane and as a result the spectral properties of the fluorescent dye are strongly affected.
In summary, the presented fluorescence spectra of laurdan can quantify the binding behaviour of sodium cholate to intact bilayer membranes and between the onset and the end of the solubilization process at different pH values. Furthermore the fluorescence data have be interpreted regarding an enrichment of the detergent at the surface or a binding deeper in the membrane bilayer.


SWD-Schlagwörter: Liposom , Lipidmembran , Fluoreszenzsonde , Gallensalze , Potentiometrie
Freie Schlagwörter (deutsch): Membranmodell , Laurdan
Freie Schlagwörter (englisch): vesicles , membrane , optical sensor , bile salt , potentiometric titration approach
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schubert, Rolf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.01.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 24.02.2005
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