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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-16795
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1679/


Schaaf, Andreas

Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. als Bioreaktor : Proteinzielsteuerung und Produktion von rekombinantem humanem Blutgerinnungsfaktor IX

Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. as bioreactor : Protein targeting and production of recombinant human blood clotting factor IX

Dokument1.pdf (3.204 KB) (md5sum: 56e7e5e497fa05ab14ac750a5277354b)

Kurzfassung in Deutsch

Das Kooperationsprojekt "Physcomitrella patens als Bioreaktor zur Produktion heterologer, pharmazeutisch relevanter Proteine" hat zum Ziel, das Laubmoos als Produktionssystem zu etablieren. Vorteile des Mooses gegenüber den zumeist verwendeten Säugerzelllinien liegen vor allem in seiner Unempfindlichkeit, hohen Wachstumsraten und den sich daraus ergebenden Möglichkeiten für eine Vergrößerung des Kulturmaßstabs. Darüber hinaus besteht kein Risiko einer Produktkontamination mit Humanpathogenen. Als höherer Eukaryot ist Physcomitrella in der Lage, komplexe, posttranslationale Modifikationen durchzuführen. Die innerhalb der Pflanzen einzigartig hohe, und damit gentechnisch nutzbare Rate homologer Rekombinationsereignisse ermöglicht unter anderem auch die Humanisierung des pflanzlichen Glykosylierungsmusters.
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Themenkomplexe des Verbundprojektes bearbeitet. Zur Optimierung der Sekretion rekombinanter Proteine wurde zunächst die Funktionalität eines humanen Signalpeptids analysiert. Die Suche nach einem mooseigenen Signal, das dem humanen gegenüber gestellt werden sollte, führte zur Isolierung von PpAP1, einer neuen, vakuolär lokalisierten Protease. Durch Fusion des PpAP1-Signalpeptids an GFP gelang zum ersten Mal in lebenden Zellen eines Bryophyten die detaillierte Darstellung des Endomembransystems aus ER und Golgi mithilfe von CLS-Mikroskopie. Diese hohe Auflösung des ER-Netztwerks war mit einer GFP-Fusion des humanen Signals nicht möglich, was eine geringere Sekretionseffizienz desselben vermuten ließ. Bestätigt wurde diese Annahme dann durch einen auf GST-Fusionen basierenden quantitativen Vergleich. Die bis zu fünffach höhere Sekretionseffizienz des endogenen Signalpeptids schlägt sich mit gleichem Wert auch in der Produktausbeute des Physcomitrella-Systems nieder.
Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde durch die Produktion des komplexen Blutgerrinungsproteins Faktor IX die Leistungsfähigkeit des Systems unter Beweis gestellt. Methodischen Vorarbeiten an Faktor IX-transgenen Pflanzen folgte die Erstellung einer zweiten, dreifach transgenen Moosgeneration. Diese Linien wurden, abgesehen von Faktor IX, noch mit zwei weiteren Expressionskassetten transformiert. Sie kodieren die für die posttranslationale Reifung von Faktor IX essentiellen Enzyme PACE und GGC, die im Moos nicht vorhanden sind. Durch homologe Integration der Konstrukte in die Genorte zweier Glykosyltransferasen sollte die Humanisierung der Produktglykosylierung bewirkt werden. Nach umfangreichen Analysen gelang die Isolierung von dreizehn Linien, die alle drei Transgene exprimieren. Drei dieser Pflanzen sind zusätzlich in einem der Glykosyxltransferasegene deletiert. Eine dieser drei Pflanzen wurde im 5l-Bioreaktor kultiviert, in dessen Kulturmedium schließlich rekombinanter Faktor IX nachgewiesen werden konnte.
Mit der Produktion dieses komplexen humanen Plasmaproteins ist es gelungen, die Leistungsfähigkeit des Produktionssystems Physcomitrella unter Beweis zu stellen, das künftig dazu beitragen könnte, den Engpass bei der Produktion rekombinanter Proteinpharmazeutika zu lösen.


Kurzfassung in Englisch

The present thesis was part of a cooperation project, which aimed to establish the moss Physcomitrella patens as a production system for pharmaceutically relevant recombinant proteins. Compared to other systems, the mosses advantages comprise, among others, its mechanical ruggedness, high growth rates and the resulting upscaling possibilities. Furthermore, a risk of product contamination by human pathogens can be excluded. As a higher eukaryote, Physcomitrella can carry out complex posttranslational modifications. Among plants, the rate of homologous recombination is uniquely high in Physcomitrella and can therefore be used as a genetic tool. This allows for the humanisation of the glycosylation pattern.
This work deals with two thematic complexes of the cooperation project. In order to optimise the secretion of recombinant proteins, the functionality of a heterologous, human signal peptide was analysed. The search for an endogenous signal, the effectiveness of which should be compared to the human one, resulted in the isolation of PpAP1, a new protease localised in the vacuole. By fusion of the PpAP1-signal peptide to GFP, the detailed visualisation of the endomembrane system in living cells of a bryophyte was achieved using CLS-microscopy. This high resolution of the ER-network could not be achieved with a GFP-fusion of the human signal, which pointed towards a lower secretion efficiency of the latter. This assumption was confirmed by a quantitative comparison based on GST-fusions. The up to five times higher secretion efficiency with the endogenous signal peptide was found to be directly reflected in the product yield of the Physcomitrella production system.
In the second part of this work the potential of the system was demonstrated by the production of the complex blood clotting protein factor IX. Methodological experiments using a first set of factor IX-transgenic plants were followed by the establishment of a second, triple transgenic moss generation. Apart from factor IX, these lines were transformed with two additional expression cassettes. The latter code for the human enzymes PACE and GGC, which are essential for posttranslational maturation of factor IX and are absent in moss. By homologous integration of the constructs into the loci of two glycosyl-transferases, the humanisation of the glycosylation-pattern should have been achieved. Extensive analysis led to the isolation of thirteen lines which express all three transgenes. Three of those are additionally knockout for one of the glycosyl-transferase genes. One of these three plants was cultured in the 5l-bioreactor, in the culture medium of which recombinant factor IX could be detected.
By producing this complex human plasma-protein the immense potential of the Physcomitrella-production system could be demonstrated. In future, this system could help to circumvent the bottleneck in the production of recombinant pharmaceutical proteins.


SWD-Schlagwörter: Biotechnologie , Physcomitrella patens , Laubmoose , Rekombinantes Protein , Hämophilie B , Biofarming , Bioreaktor , Sekretion
Freie Schlagwörter (deutsch): molecular farming , aspartische Protease , Vakuole , GST
Freie Schlagwörter (englisch): molecular farming , moss , bioreactor , secretion , haemophilia B , factor IX
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Reski, Ralf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.02.2005
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 09.03.2005
Bemerkung: Schaaf et al (2004). A novel aspartic proteinase is targeted to the vacuole via the secretory pathway in a moss, Physcomitrella patens. Eur. J. Cell Biol. 83: 145-152.
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