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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-18235
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1823/


Rakhmanov, Mirzokhid

Analysis of B lymphocyte activation and differentiation by expression profiling

Analyse der Aktivierung und Differenzierung von B Lymphozyten durch Expressionsprofile

Dokument1.pdf (6.753 KB) (md5sum: d91ff7ff3cb7677a5417f9728f00db28)

Kurzfassung in Englisch

B cell development is severely impaired in the absence of SLP65 adaptor protein. SLP65-deficient B cells are arrested at the large cycling pre-B cell stage in the bone marrow and transitional B cell stages in the spleen of mice. The zinc-finger transcription factor EGR1 is an immediate early gene induced upon Ag-binding and BCR engagement in B cells. EGR1 promotes B cell differentiation and maturation at the progression from pro-B to pre-B and into the mature B cell stages. The main hypothesis of this study was that EGR1 expression is regulated through a SLP65-dependent signaling chain and therefore, EGR1 overexpression in SLP65-/- mice could restore or at least partially rescue developmental blocks caused by the absence of SLP65 in B cells. The results revealed that both EGRxSLP65-/- and SLP65-/- B cells appear to be arrested at the same developmental (large pre-B cell) stage, suggesting that in the absence of SLP65, EGR1 activity alone is not sufficient to rescue the developmental block in the bone marrow. However, independent of this developmental arrest EGR1 overexpression mediates downregulation of IL-2R alpha chain in B cells. Further analysis showed that although EGR1 could not completely rescue the developmental arrest at the transitional B cells stages in EGRxSLP65-/- mice, splenic B cells from EGRxSLP65-/- mice have a more mature phenotype compared to splenic B cells from SLP65-/- animals. In order to determine the underlying molecular basis of these EGR1-mediated phenotypic changes in EGRxSLP65-/- B cells as well as to identify additional EGR1 target genes in B cells, gene expression profiling experiments were performed. By microarray hybridizations and several validation methods at least nine genes were found to be differentially regulated in EGRxSLP65-/- B cells. Inspection of the promoter sequences suggests that seven genes: Ly-6A/E, TAF10, SLFN1, SLFN2, CalA, CCR2 and Oct1 might be potential EGR1 target genes in B cells. Ly-6D and Ly-6E are upregulated in both EGRxSLP65-/- and SLP65-/- B cells, since the cells are T1 and T2 B cells. We also could show that IRF1 is downregulated upon BCR cross-linking in SLP65-/- B cells. In addition, we found that the SLP65-/- B cells express low levels of TACI and the expression levels of TACI is drastically reduced in EGRxSLP65-/- B cells. Due to the block at the large pre-B cell stage SLP65-/- mice develop pre-B ALL leukemia in 5-10% of cases. Consistent with these data we found pre-B ALL formation in about 6.78% of SLP65-/- mice. Surprisingly, the pre-B ALL incidence was twice as high (13.33%) in EGRxSLP65-/- mice. Searching for possible candidate genes which might be involved in pre-B ALL formation, we found that LEF1 and IRF1 might be associated with tumor formation in pre-B cells. Our results strongly suggest that EGR1 might play a role in pre-B ALL progression by directly regulating LEF1 in pre-B cells.


Kurzfassung in Deutsch

Die B-Zellentwicklung wird durch Abwesenheit des Adaptorproteins SLP65 stark beeinträchtigt. SLP65-defizienten Mäusen differenzieren B-Zellen nur bis zum Stadium der großen, sich teilenden Prä-B-Zellen im Knochenmark sowie zu Transitional-B-Zellen in der Milz. Der Transkriptionsfaktor EGR1 gehört zur Gruppe der unmittelbar frühen Gene, welche nach Antigenaufnahme und B-Zellrezeptorstimulation in B-Zellen induziert werden. EGR1 fördert die Differenzierung und Reifung von B-Zellen beim Übergang vom Pro-B zum Prä-B-Stadium und zu reifen B-Zellstadien. In der dieser Arbeit zugrundeliegenden Hypothese wurde von einer Regulation der EGR1-Expression durch eine SLP65-abhängige Signalkaskade ausgegangen. Eine Überexpression von EGR1 in SLP65-/- Mäusen sollte daher die Blockaden in der B-Zellentwicklung, welche durch die Abwesenheit von SLP65 hervorgerufen werden, ganz oder zumindest teilweise überwinden. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl EGRxSLP65-/-, als auch SLP65-/- B-Zellen im Stadium der großen Prä-B-Zelle verbleiben. Dies legt nahe, dass die Aktivität von EGR1 in Abwesenheit von SLP65 nicht ausreicht, um den Entwicklungsblock im Knochenmark aufzuheben. Unabhängig von dieser Entwicklungsblockade wird jedoch durch die Überexpression von EGR1 in den B-Zellen die Expression der IL-2R alpha-Kette herunterreguliert. Aus weiteren Analysen ergab sich, dass der Entwicklungsblock in den Transitionalstadien in EGRxSLP65-/- Mäusen zwar von EGR1 nicht aufgehoben werden kann, dass aber B-Zellen aus den Milzen dieser Mäuse einen reiferen Phänotyp aufweisen, als es bei B-Zellen aus den Milzen von SLP65-/- Mäusen der Fall ist. Um die dafür verantwortlichen, molekularen Grundlagen der EGR1-vermittelten phänotypischen Veränderungen in EGRxSLP65-/- B-Zellen zu erforschen, und um zusätzliche EGR1-Zielgene in B-Zellen aufzudecken, wurden Genexpressionsanalysen durchgeführt. Durch Microarray-Hybridisierungen und mehrere, die Ergebnisse bestätigende Methoden wurden mindestens neun Gene gefunden, die in EGRxSLP65-/- B-Zellen differenziell reguliert werden. Die Untersuchung der Promotersequenzen deutet darauf hin, dass es sich bei den sieben Genen Ly-6A/E, TAF10, SLFN1, SLFN2, CalA, CCR2 und Oct1 um potentielle EGR1-Zielgene in B-Zellen handelt. Ly-6D und Ly-6E werden sowohl in EGRxSLP65-/- als auch in SLP65-/- B-Zellen verstärkt exprimiert, da diese Zellen T1 und T2 B-Zellen darstellen. Wir konnten weiterhin zeigen, dass in SLP65-/- B-Zellen nach BCR-Kreuzvernetzung IRF1 herunterreguliert wird. Darüberhinaus fanden wir eine geringere Expression von TACI in SLP65-/- B-Zellen, die sich in EGRxSLP65-/- B-Zellen noch als deutlich stärker vermindert erwies.
Aufgrund des Blockes im großen Prä-B-Zellstadium entwickeln SLP65-/- Mäuse in 5-10% der Fälle Prä-B ALL Leukämien. In Konkordanz mit diesen Daten konnten wir die Entwicklung von Prä-B ALL in etwa 6,78% der SLP65-/- Mäuse beobachten. Überraschenderweise war das Auftreten von Prä-B ALL in EGRxSLP65-/- Mäusen etwa doppelt so hoch (13,33%). Die Suche von möglichen Kandidatengenen, welche an der Entwicklung von Prä-B ALL beteiligt sein könnten, ergab eine mögliche Assoziation von LEF1 und IRF1 mit der Tumorentstehung in Prä-B-Zellen. Unsere Ergebnisse legen eine Rolle von EGR1 bei der Progression von Prä-B ALL durch die direkte Regulation von LEF1 in Prä-B-Zellen nahe.


SWD-Schlagwörter: B-Lymphozyt , Microarray , B-Zell-Leukämie
Freie Schlagwörter (englisch): B Cell Differentiation, microarrays, EGR1 target genes, pre-B ALL
Institut: Medizinische Univ.-Klinik und Poliklinik
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Eibel, Hermann (Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.07.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 27.06.2005
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