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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-18924
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1892/


Mayer, Almuth

Untersuchungen zur Funktion und Spezifität von Glykosyltransferasen

Studies on function and specificity of glycosyltransferases

Dokument1.pdf (1.169 KB) (md5sum: 58cb0cc0ff8aca1511fb168065983a57)

Kurzfassung in Deutsch

Urdamycin A und Landomycin A sind glykosidierte Angucycline aus Streptomyces fradiae Tü2717 bzw. Streptomyces cyanogenus S136. Die beiden Substanzen stimmen in ihren Grundstrukturen überein, jedoch weist Landomycin A im Vergleich zum Urdamycin A zwei zusätzliche Hydroxylgruppen (an C-6 und C-11) und einen aromatischen A-Ring auf. Außerdem liegt im Landomycin A ein O-glykosidisch verknüpfter Hexasaccharidrest (D-Olivose-D-Olivose-L-Rhodinose)2, im Urdamycin A hingegen ein C-glykosidisch gebundenes Trisaccharid D-Olivose-L-Rhodinose-D-Olivose vor.
Die Glykosyltransferasen UrdGT2 bzw. LanGT2 katalysieren den ersten Glykosidierungsschritt in der Urdamycin A bzw. Landomycin A Biosynthese. UrdGT2 verknüpft die erste D-Olivose C-glykosidisch in Position 9 der Angucyclinstruktur, LanGT2 überträgt ebenfalls die erste D-Olivose, aber O-glykosidisch und in Position 8 des Aglykons. Beide Enzyme sind zu 41% auf Aminosäureebene identisch. LanGT2 zeigt keine Aktivität in S. fradiae: Die Expression von lanGT2 in S. fradiae A0 (urdGT2-) führt nicht zur Glykosidproduktion.
Im Rahmen dieser Arbeit gelang es erstmalig ein Akzeptorsubstrat für LanGT2 in S. fradiae A0 zu generieren und dadurch Aktivität für LanGT2 zu erzielen: Die Expression eines Abschnitts aus dem Landomycin A Biosynthesecluster, welcher lanV und lanGT2 enthielt, führte zur Bildung von Landomycin H, einem monoglykosidierten Angucyclin mit aromatischem A-Ring. Dies zeigte, dass ein Akzeptorsubstrat von LanGT2 einen aromatischen A-Ring aufweisen muss. LanV konnte darauf als bifunktionales Enzym mit Aromatase- und Dehydrogenasefunktion in S. fradiae delta urdM charakterisiert werden. Ebenfalls konnte mit demselben Experiment eine zweite, bisher unbekannte, Funktion von UrdM aufgeklärt werden. In der Urdamycin A Biosynthese katalysiert UrdM neben der Hydroxylierung in 12b-Position auch die Reduktion der Ketogruppe an C-6.
Um die spezifitätsbestimmenden Proteinbereiche von UrdGT2 und LanGT2 einzugrenzen, wurden Hybride aus den Glykosyltransferasen hergestellt und in S. fradiae A0 auf Aktivität getestet. Man erhielt funktionale hybride Enzyme. Entsprechend der Aminosäuresequenz dieser Hybride ist der mittlere Proteinbereich (AS 130-266) nicht ausschließlich essentiell für eine UrdGT2- bzw. LanGT2-artige Enzymspezifität.
Mit S. fradiae A0 als Wirtsstamm wurden zwei weitere Genfunktionen durch heterologe Expression aufgeklärt: LanZ5 aus dem Landomycin A Biosynthese Cluster ist eine Hydroxylase und SimB7 aus dem Simocyclinon D8 Biosynthesecluster ist eine C-Glykosyltransferase. Die Expression von lanZ5 führte zur Bildung eines an C-11 hydroxylierten Urdamycins, die Expression von simB7 zur Produktion von C-glykosidierten Derivaten.
Des Weiteren wurde UrdGT2 löslich in S. fradiae A0 exprimiert. Mit aufgereinigtem Protein wurde ein Kristallisationsansatz durchgeführt. Dabei erhielt man Proteinkristalle.
Außerdem wurde das Biosynthesecluster für Aranciamycin, einem glykosidierten Anthracyclinantibiotikum aus S. echinatus Tü303, aufgestellt. Die Sequenz eines Cosmids aus der S. echinatus-Genbank wurde analysiert und die orfs bestimmt. Der Biosyntheseweg wurde anhand der gefundenen putativen Gene erklärt.


Kurzfassung in Englisch

Urdamycin A and landomycin A are glycosylated angucyclines from Streptomyces fradiae Tü2717 and Streptomyces cyanogenus S136 respectively. Both substances show the same basic structure, however landomycin A contains - compared to urdamycin A - two additional hydroxyl groups (at C-6 and C-11) and an aromatic ring A. In addition landomycin contains an O-glycosidic bound hexasaccharide chain (D-olivose-D-olivose-L-rhodinose)2, urdamycin A exhibits in contrast a C-glycosidic bound trisaccharide (D-olivose-L-rhodinose-D-olivose). The glycosyltransferases UrdGT2 and LanGT2 catalyze the first glycosylation step in urdamycin A and landomycin A biosynthesis respectively. UrdGT2 links the first D-olivose C-glycosidically to position 9 of the angucyclic structure. LanGT2 transfers the first D-olivose likewise, however O-glycosidically and to C-8 of the aglycon. Both enzymes share 41% identical amino acids. LanGT2 is not active in S. fradiae: The expression von lanGT2 in S. fradiae A0 (urdGT2-) does not result in glycosid production.
In this work an acceptor substrate for LanGT2 was generated for the first time in S. fradiae A0, by what LanGT2 became active in S. fradiae A0: The expression of a fragment of the landomycin A biosynthesis cluster, which contained lanV und lanGT2, resulted in the production of landomycin H, a monoglycosylated angucycline with an aromatic ring A. This shows that acceptor substrates of LanGT2 require an aromatic ring A. Subsequent LanV was characterized as a bifunctional enzyme in S. fradiae delta urdM: LanV is an aromatase as well as a dehydrogenase. In addition a second, so far unknown, function of UrdM was elucidated by the same experiment: During urdamycin A biosynthesis UrdM catalyzes beside the hydroxylation at C-12b the reduction of the ketogroup at C-6.
Intending to find the protein regions of UrdGT2 and LanGT2 which determine enzyme specificities, hybrids were generated and tested for activity in S. fradiae A0. Some hybrids were active. According to their amino acid sequences the middle part of UrdGT2 and LanGT2 (amino acids 130-266) is not excludingly essential for an UrdGT2- and a LanGT2-like specificity. Two additional enzyme functions were elucidated using S. fradiae A0 as host strain: LanZ5 from the landomycin A biosynthesis cluster represents a hydroxylase and SimB7 from the simocyclinon D8 pathway a C-glycosyltransferase. The expression of lanZ5 resulted in the production of an urdamycin hydroxylated at C-6, the expression of simB7 led to production of C-glycosylated derivatives.
Furthermore UrdGT2 was expressed in soluble form in S. fradiae A0. Purified protein served for a crystallisation experiment resulting in protein crystals.
Moreover the biosynthesis cluster of aranciamycin was set up. Aranciamycin is a glycosylated angucyclic antibiotic from S. echinatus Tü303. Sequence analysis of a cosmid deriving from the genbank of S. echinatus was performed. The orfs were identified. The aranciamycin pathway was proposed according to identified putative genes.


SWD-Schlagwörter: Glycosyltransferasen , Streptomyces , Spezifität , Reductasen , Biosynthese
Freie Schlagwörter (deutsch): Glykosyltransferasen aus Streptomyeten , Enzymspezifität , SDR-Enzyme , Biosynthese von Aranciamycin, Landomycin A und Urdamycin A
Freie Schlagwörter (englisch): glycosyltransferases from streptomycetes , specificity , SDR-enzymes , biosynthesis of aranciamycin, landomycin A and urdamycin A
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 01.07.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 03.08.2005
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