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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-19435
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1943/


Huth, Ulrich Stephan

Zelluläre Aufnahme und intrazelluläres Schicksal von partikulären Drug Delivery Systemen

Cellular uptake and intracellular fate of particulate drug delivery systems

Dokument1.pdf (11.198 KB) (md5sum: 15cee40af1bbea6d8d960435965b57a5)

Kurzfassung in Deutsch

Das intrazelluläre Schicksal von makromolekularen Arzneistoffen und partikulären Arzneistoffträgern wird maßgeblich durch die Aufnahme in die Zelle und das sich daran anschließende intrazelluläre Trafficking bestimmt. Neben der "klassischen" Clathrin-vermittelten Endozytose existieren verschiedene Wege für die partikuläre Aufnahme in die Zelle, wie Phagocytose, Makropinocytose, Caveolae-vermittelte Endozytose und so genannte Non-Clathrin-non-Caveolae vermittelte Endozytose. Von diesen Wegen erscheint die Internalisierung mittels Caveolae besonders viel versprechend für ein gezieltes Drug Targeting zu sein, da hier das internalisierte Material nicht zu Endosomen und zur lysosomalen Degradierung geführt wird, sondern auf anderen Wegen in verschiedene Kompartimente der Zelle gelangt. Die Kenntnis der Internalisierung ist für die gezielte Entwicklung von Drug Delivery Systemen von grundlegender Bedeutung. In bisherigen Studien wurde lediglich untersucht, ob Liposomen internalisiert werden, oder es wurden einzelne Aspekte der Endozytose, wie die Beteiligung des Clathrin-vermittelten Weges oder die Aktivität von Mikrotubuli-Filamenten betrachtet. Mit dieser Arbeit werden erstmals die Aufnahme und das Schicksal von pH-sensitiven Liposomen und Polymer-basierten Gentransfersystemen (Polyplexen) unter Berück-sichtigung der gesamten Komplexität der Endozytose und des intrazellulären Verhaltens untersucht.
Für die Studien wurden mit dem Spectral Bio-Imaging und der Durchflusszytometrie zwei voneinander unabhängige Methoden verwendet. Mit der ortsauflösenden oder bildgebenden spektroskopischen Methode des Spectral Bio-Imaging wird die Kolokalisation von Fluoreszenz-gelabelten Endozytosemarkern und markierten Liposomen/Polyplexen untersucht. Die Etablierung der Methode in der Zellbiologie war ein Kernstück dieser Arbeit. Die durchflusszytometrische Analyse diente der quantitativen Erfassung der Effekte von spezifischen Endozyotseinhibitoren, welche die Liposomenaufnahme durch Blockade eines bestimmten Endozytosemechanismus hemmen soll.
Es konnte gezeigt werden, dass pH-sensitive Liposomen überwiegend mittels Endozytose internalisiert werden. Jedoch spielt auch eine Fusion von Liposomen mit der Zellmembran eine Rolle. HUVEC (primäre Endothelzellen der Nabelschnur) und COS-7 Zellen (Karzinom-Zelllinie einer afrikanischen Affenart) zeigten eine gleichzeitige Internalisierung der Liposomen über verschiedene Mechanismen. HUVEC nutzen den Mechanismus der Clathrin-vermittelten Endozytose, der Makropinozytose, sowie die Aufnahme mittels Caveolae. COS-7 Zellen unterscheiden sich hier deutlich: während ebenfalls Clathrin-vermittelte als auch Caveolae-vermittelte Aufnahme eine Rolle spielt, wird der Weg über Makropinozytose hier nicht genutzt.
Untersuchungen zur Aufnahme von Polyplexen, bestehend aus den Polymeren pDMAEMA (Poly(2-dimethylamino)ethylmetacrylat) oder PEI (Polyethylenimin) und DNA, ergaben das folgende Bild: Der Mechanismus der Makropinozytose scheint für die Aufnahme beider Polyplexe in COS-7 Zellen keine Rolle zu spielen. Die Aufnahme von pDMAEMA und PEI-Polyplexen kann sowohl mittels Clathrin, als auch über Caveolae-vermittelte Endozytose erfolgen. Da der erste Schritt der Aufnahme das weitere intrazelluläre Verhalten der Polyplexe bestimmt, wurden Effekte der Aufnahmehemmung auf die Genexpression untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass nur die Aufnahme mittels Caveolae zur Genexpression führt. Der Aufnahmemechanismus von DNA-Aggregaten mit Polymeren ist demnach von entscheidender Bedeutung für die Gentherapie. Bisher wurde überwiegend die Freisetzung von Polyplexen aus aciden Endosomen untersucht. Mit dieser Studie wird deutlich, dass die Erforschung des Aufnahmemechanismus und ein gezieltes Targeting der Caveolae-vermittelten Endozytose für eine optimierte Gentherapie unabdingbar sind.
Die Möglichkeiten des spektralen Imaging-Systems wurden in einem weiteren Projekt gezeigt. Die intrazelluläre Verteilung des Proteins Mdg1 (mikrovaskuläres Differenzierungsgen 1) und die für das Verteilungsmuster notwendigen Domänen konnten charakterisiert werden. Hierzu wurden verschiedene Mdg1-GFP-Fusionsproteine in HeLa Zellen exprimiert und mittels Spectral Bio-Imaging die Lokalisation in der Zelle verfolgt.
Die vorliegende Arbeit bildet die Grundlage für eine gezielte Entwicklung bzw. Modifizierung von modernen Drug Delivery Systemen. Nachdem am Beispiel von pH-sensitiven Liposomen und Polymer-basierten Gentransfersystemen gezeigt wurde, dass verschiedene Zellen unterschiedliche Endozytosemechanismen verwenden, kann als nächster Schritt die gezielte Nutzung dieser Wege erfolgen.


Kurzfassung in Englisch

The intracellular fate of particulate drug delivery systems is determined by the initial mode of internalization and the following intracellular trafficking. Besides clathrin-mediated endocytosis different cellular uptake mechanisms are discussed for internalization including caveolae-mediated endocytosis, phagocytosis, macropinocytosis and non-clathrin non-caveolae-mediated endocytosis. In addition, fusion processes could also be included. For a targeted drug delivery the mechanism of caveolae uptake seems to be most promising since it does not transport internalized material directly to endosomes and lysosomes where the material might be degraded. Therefore the first step for an optimized drug targeting is the knowledge of the mode of internalization.
Previous work has shown that the majority of cells internalize liposomes through an endocytic pathway, however most studies only investigate whether liposomes are internalized or not. Others focus on some aspects of endocytosis like the involvement of the metabolic activity and the function of the microtubule network, or investigate the clathrin-mediated endocytosis and the dependence on actin cytoskeleton without considering caveolae uptake.
This study deals with the uptake and fate of pH-sensitive liposomes and cationic polymer-DNA with regard to the complexity of endocytosis and the following trafficking in the cell.
For studying the uptake of pH-sensitive liposomes into HUVEC and COS-7 cells two independent methods, spectral bio-imaging and flow cytometry (FACS), were applied. The spectroscopic method spectral bio-imaging was used to verify co-localization of different fluorescently labeled markers that are known to be internalized via a specific endocytic pathway and labeled liposomes/polyplexes. The method enables the detection and separation of several, even spectrally overlapping dyes in one measurement. The establishment of this method in cell biology was one main aspect of this thesis. Flow cytometric analysis was used to gain quantitative information in terms of uptake kinetics and the extent of uptake inhibition after treatment with selected inhibitors.
It was shown that pH-sensitive liposomes composed of the lipids dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) and cholesteryl hemisuccinate (CHEMS) are mainly internalized by HUVEC and COS-7 cells via endocytosis. However, fusion effects also seem to be involved. Internalization via endocytosis is not only restricted to one distinct pathway but several processes might be utilized in parallel. Besides clathrin-mediated uptake pH-sensitive liposomes also seem to be internalized via caveolae-mediated endocytosis. Regarding macropinocytosis we showed that pH-sensitive liposomes are internalized differently by different cells. Internalization of pH-sensitive liposomes into COS-7 cells does not seem to occur via macropinocytosis whereas this type of endocytosis is employed in HUVEC.

Studies with cationic polymer-DNA-polyplexes composed of DNA and the cationic polymer pDMAEMA (poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) or PEI (polyethylenimine) showed that macropinocytosis does not seem to be involved in internalization of both kinds of polyplexes into COS-7 cells. The DNA aggregates are taken up via a clathrin-mediated pathway and/or via caveolae.
Since the initial mode of internalization determines the intracellular fate, the effects of the different endocytic pathways were evaluated with regard to gene expression. It was shown that only the uptake via caveolae contributes to gene expression. Until now the focus was mainly set on studying the escape from the acidic environment of endosomes, but with the present data we conclude that more emphasis should be put on intracellular targeting via the caveolar/lipid raft pathway.

Additionally the subcellular localization of the protein Mdg1 (microvascular endothelial differentiation gene 1) and its distribution pattern with regard to different parts of the protein were characterized. For this study HeLa cells were transfected with different Mdg1-GFP plasmids and the localization was investigated with spectral bio-imaging.
The presented work is the basis for the systematic development and modification of modern drug delivery systems. It was shown with pH-sensitive liposomes and polymer based gene transfer systems that different cells utilize different endocytic mechanisms. With this knowledge selection of a specific pathways can be used for targeted drug delivery.


SWD-Schlagwörter: Liposom , Lipoplexe , Targeted drug delivery , Endocytose , Clathrin
Freie Schlagwörter (deutsch): Spektrales Imaging , pH-sensitive Liposomen
Freie Schlagwörter (englisch): spectral bio-imaging , pH-sensitive liposomes
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schubert. Rolf (Prof. Dr.)
Quelle: Cytometry; Liposome Technolgy
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.06.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 11.08.2005
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