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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-19504
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1950/


Clement, Jule

Methoden zur Charakterisierung von großtechnisch hergestellten Lipoplexen zum Gentransfer

Methods for the characterisation of lipoplexes prepared in large-scale for gene transfer

Dokument1.pdf (2.672 KB) (md5sum: 412896691d2689068e3df3fd399ed30b)

Kurzfassung in Deutsch

Die Instabilität von lipidbasierten Gentransfersystemen und die damit verbundene Schwierigkeit der großtechnischen Herstellung und Lagerung ist ein schwerwiegendes Problem für die Entwicklung und Anwendung gentherapeutischer Arzneimittel.
Im Rahmen dieser Arbeit wird eine eingehende Charakterisierung von Lipoplexen, durchgeführt, die durch ein kontinuierliches Verfahren mit anschließender Lyophilisation in großem Maßstab hergestellt wurden. Hierzu wurden Methoden für die Analytik der biologischen Aktivität und physikochemischen Stabilität entwickelt. Die Stabilität der Lipoplexe wurde über einen Zeitraum von 11 Monaten verfolgt und es wurde die Reproduzierbarkeit des Herstellverfahrens und der Methoden zur Quantifizierung der Ausgangssubstanzen untersucht.
Um strukturelle Einflüsse des Transfektionsreagenzes zu untersuchen wurden Lipoplexe aus DNA und den liposomalen Transfektionsreagenzien DAC-30 und DC-30, welche beide aus dem neutralen Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und den kationischen Cholesterolderivaten DAC-Cholesterol (3ß-[N-(N,N´-dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterol) bzw. DC-Cholesterol (3ß-[N-(N´,N´-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterol) im Verhältnis 7:3 (w/w) bestehen, analysiert.
Um die Besonderheiten der großtechnischen Herstellung zu erfassen, wurden zur Entwicklung der Methoden Lipoplexe eingesetzt, die in kleinem Maßstab durch Pipettieren hergestellt wurden und mit den im großen Maßstab hergestellten lyophilisierten und redispergierten Lipoplexen verglichen. Die biologische Aktivität wurde durch die Bestimmung der Transfektionseffizienz mittels Durchflusszytometrie ermittelt. Zur Untersuchung der Auswirkung auf die Zellviabilität erwies sich ebenfalls die durchflusszytometrische Analyse als geeignet. Die physikochemische Stabilität der Lipoplexe wurde auf verschiedene Arten untersucht. Die Partikelgröße und Struktur wurden durch Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) und Cryotransmissions-Elektronenmikroskopie (Cryo-TEM) bestimmt. Die Struktur wurde weiterhin durch die Bestimmung der DNA-Zugänglichkeit in Lipoplexen mittels eines Fluoreszenzassays und Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt. Die Oberflächenladung der Partikel wurde durch Zetapotentialmessungen und fluorimetrische Untersuchungen ermittelt. Außerdem wurden Assays zur Quantifizierung der Ausgangssubstanzen Lipid und DNA entwickelt. Spektroskopische Methoden dienten zur Quantifizierung des DOPE-Anteils im Lipid, mit einer HPTLC-Methode konnten sowohl der DOPE-, als auch der Cholesterol-Anteil bestimmt werden. Die Bestimmung des DNA-Anteils wurde ebenfalls mit spektroskopischen Methoden durchgeführt. Die Lyophilisate wurden durch Bestimmung des Restfeuchtegehaltes und durch rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen charakterisiert.
Stabilitätsuntersuchungen der lyophilisierten Lipoplexe ergaben, dass die Transfektionseffizienz über den untersuchten Zeitraum nicht abnahm. Partikelgröße und -ladung veränderten sich nicht signifikant, Lipid- und DNA-Gehalt blieben über den gesamten Zeitraum hinweg erhalten.
Hinsichtlich der Reproduzierbarkeit des Herstellungsverfahrens konnte festgestellt werden, dass Lipoplexe mit gleichbleibenden Eigenschaften produziert werden konnten. Mit den Methoden zur Quantifizierung von Lipid und DNA wurden einheitliche Ergebnisse erzielt, allerdings ergaben sich zwischen den mit den verschiedenen Methoden erzielten Ergebnissen Unterschiede.
Zwischen den physikochemischen Eigenschaften der DAC-30 bzw. DC-30-haltigen Lipoplexe ließen sich keine signifikanten Unterschiede feststellen. Die mit DAC-30-haltigen Lipoplexen erzielte Transfektionseffizienz lag jedoch bei ähnlich ausgeprägter Zytotoxizität deutlich über der biologischen Aktivität der DC-30-haltigen Lipoplexe.


Kurzfassung in Englisch

The instability of lipid based systems for gene transfer and the related difficulties of large-scale production and storage is a major problem for their development and application.
Within this work extensive characterisation of continuously prepared lipoplexes in large scale followed by lyophilisation has been carried out. Analytical methods for the evaluation of biological activity and physicochemical stability have been developed. Stability of lipoplexes was evaluated over a period of 11 months and reproducibility of the production process and methods for quantification of lipid and DNA were investigated.
For the study of structural influences of the transfection reagent lipoplexes consisting of DNA and the liposomal transfection reagents DAC-30 and DC-30 were investigated. Both transfection reagents consist of the neutral lipid dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) and the cationic cholesterol derivatives DAC-Cholesterol (3ß-[N-(N,N´-dimethylaminoethane)-carbamoyl]-cholesterol) and DC-Cholesterol (3ß-[N-(N´,N´-dimethylaminoethane)-carbamoyl]-cholesterol), respectively, in the ratio 7:3 (w/w).
For the establishment of the methods lipoplexes prepared in small scale by pipetting were used and compared to large-scale lipoplexes in order to comprehend the characteristics of the large-scale production process. Transfection efficiency was measured using flow cytometry, which was also applicable for the investigation of the effect of transfection on cell viability. Physicochemical stability of the lipoplexes was examined in different ways. Particle size and structure were analysed by photon correlation spectroscopy (PCS) und cryotransmission electron microscopy (Cryo-TEM). Furthermore, structure was investigated by examination of the DNA accessibility in the lipoplexes for fluorescent probes and by agarose gel electrophoresis. The surface charge of the particles was analysed performing zeta potential measurements and fluorimetric analysis. Besides, assays for the quantification of lipid and DNA were developed. Spectroscopical methods served for the quantification of the DOPE fraction in the lipid. By performing HPTLC, both, DOPE and cholesterol derivatives, could be analysed. The DNA content was also investigated by spectroscopical analysis. The lyophilisates were characterised by examining the remaining moisture and by raster electron microscopy (REM).
Stability examinations of lyophilised lipoplexes showed that transfection efficiency did not decrease over the investigated period of time. Particle size and charge did not change significantly. Lipid and DNA content was maintained over the whole period.
Regarding the reproducibility of the production process it could be shown that lipoplexes with constant characteristics were prepared.
No significant difference could be seen between the physicochemical properties of the DAC-30 and DC-30 containing lipoplexes. However, the transfection efficiency achieved with the DAC-30 containing lipoplexes was significantly higher than with the DC-30 containing lipoplexes, whereas, cytotoxicity of both formulations was comparable.


SWD-Schlagwörter: Lipoplexe , Gentransfer , DNS
Freie Schlagwörter (deutsch): nicht-viraler Gentransfer , kationisches Lipid , großtechnische Herstellung , Charakterisierungsmethoden
Freie Schlagwörter (englisch): non-viral gene transfer , analytical methods , cationic lipid , DNA , large-scale production
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Peschka-Süss, Regine (Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 16.08.2005
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