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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-19770
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/1977/


Pielen, Amelie

Neuroprotektion retinaler Ganglienzellen : Gabapentin-Laktam und die Neuropeptide NAP und Activity-dependent neurotrophic factor-9 in Kulturen isolierter Ganglienzellen und Netzhautexplantate der Ratte

Neuroprotection of rat retinal ganglion cells : gabapentin-lactam and neuropeptides NAP and Activity-dependent neurotrophic factor-9 in cultures of isolated retinal ganglion cells and cultures of retinal explants

Dokument1.pdf (1.008 KB) (md5sum: 75bef792b7d478bfac42e77fb0e1ad7b)

Kurzfassung in Deutsch

GBP-L, das sich von Gabapentin ableitet, besitzt neuroprotektive Eigenschaften in vivo, vermutlich über das Öffnen mitochondrialer KATP-Kanäle. In der vorliegenden Arbeit untersuchte ich diese Hypothese an Kulturen isolierter retinaler Ganglienzellen (RGZ).
RGZ neugeborener Ratten (P0 - P2) wurden mit Thy-1-Immunopanning isoliert und 48 h kultiviert. Das Überleben wurde durch Zählung vitaler RGZ am Phasen-Kontrast-Mikroskop quantifiziert. RGZ wurden mit GBP-L (3,2 - 320 µM) behandelt mit und ohne vorherige Inkubation der Kulturen mit 1 µM Gibenclamid, welches plasmalemmale und mitochondriale KATP-Kanäle blockiert, oder mit 100 µM 5-Hydroxydecanoat (5-HD), spezifischer Antagonist mitochondrialer KATP-Kanäle. Zum Vergleich wurden RGZ mit 32 µM Gabapentin inkubiert. Als Positivkontrolle diente CNTF plus BDNF (je 50 ng/ml).
GBP-L steigerte das Zellüberleben konzentrationsabhängig auf bis zu 145 %. Glibenclamid verringerte den protektiven Effekt von GBP-L im Sinne eines kompetitiven Antagonisten. Der spezifische KATP-Kanal-Blocker 5-HD hemmte den Effekt. Gabapentin zeigte keine Wirkung auf das Überleben. CNTF plus BDNF führte zu einer Überlebensrate von 177 %.
Die Ergebnisse zeigen, dass GBP-L im Unterschied zu Gabapentin das Überleben der RGZ fördert, wahrscheinlich indem es mitochondriale KATP-Kanäle öffnet.

Aktuelle Studien demonstrieren den neuroprotektiven Effekt der Peptide ADNF-9 und NAP. Im gleichen Kultursystem testete ich die Wirkung der Neuropeptide auf isolierte RGZ und untersuchte nachfolgend das Neuritenwachstum in Kulturen von Netzhautexplantaten.
RGZ wurden mit NAP oder ADNF-9 (10-18 M bis 10-10 M) behandelt. Netzhautexplantate von älteren Ratten (P9-P11) wurden in einer Fibrinmatrix (72 h) kultiviert und mit 1 µM NAP oder ADNF-9 behandelt. Die aussprossenden Neuriten wurden nach Sudanschwarz-Färbung am Mikroskop beurteilt und die Wachstumsrate im Vergleich zu den Kontrollen bestimmt.
Beide Peptide erhöhten die Überlebensrate der isolierten RGZ, ADNF-9 (0,1 pM) auf 177 %, NAP (5 pM) auf 167 %. In den Explantatkulturen steigerten sie das Neuritenwachstum im Vergleich zu den Kontrollen, ADNF-9 führte zu 126 %, NAP zu 117 %.
Die Peptide fördern nicht nur das Überleben isolierter Nervenzellen sondern auch das Neuritenwachstum bei Netzhautexplantaten. Weitere Untersuchungen in vitro und in vivo sind nötig, um GBP-L oder NAP und ADNF-9 als neuroprotektive Pharmaka in der Therapie von Erkrankungen der Retina und des optischen Nervs einsetzen zu können.


Kurzfassung in Englisch

PURPOSE. Recent studies demonstrated that short peptides derived
from activity-dependent neurotrophic factor (ADNF) and
activity-dependent neuroprotective protein (ADNP) are neuroprotective
at femtomolar concentrations. We evaluated these
findings in cultures of purified rat retinal ganglion cells (RGCs)
using two such peptides: ADNF-9 and NAP. In a second step,
the influence of these peptides on neurite outgrowth in retinal
explants was investigated.
METHODS. Retinal ganglion cells (RGCs) were purified from
newborn (postnatal day [P]0 - P2) rat retina by immunopanning
with antibodies against Thy1.1 and were cultured in serum-free
N2 medium for 2 days. RGCs were treated with ADNF-9 and
NAP at concentrations ranging from 10(-18) to 10(-10) M. Survival
was quantified by counting viable cells by phase-contrast microscopy.
Retinal explants from postnatal (P9-P11) rats were
cultured in three-dimensional fibrin clots in serum-free medium
for 3 days. Explants were treated with 1 µM NAP or 1 µM
ADNF-9. Neurite outgrowth was visualized by staining with
Sudan black and quantified by measuring axonal length.
RESULTS. Both peptides enhanced survival of RGCs in a dosedependent
manner. ADNF-9 showed a maximum effect at 0.1
pM with an increase in survival to 177% (95% confidence
interval: 149-204) of the control level. The EC50 was 10.9 fM.
NAP showed a maximum effect at 5 pM with an increase in
survival to 167% (146-189) and an EC50 of 6.1 fM. In the
explants, 1µM ADNF-9 enhanced axonal outgrowth to 126%
(118-133) and 1µM NAP to 117% (98-137) compared with
the control.
CONCLUSIONS. Both peptides, ADNF-9 and NAP, not only increase
RGC survival in vitro but also support neurite outgrowth
in retinal explants. These peptides deserve further attention as
potential neuroprotective compounds in retinal and optic
nerve diseases.
Background: Recently, gabapentin-lactam (GBP-L) was shown to be neuroprotective in vivo. It has been suggested that it may act by opening mitochondrial ATP-sensitive potassium (KATP) channels. We tested this hypothesis by quantifying the effect of GBP-L on the survival of purified retinal ganglion cells (RGCs).
Methods: RGCs were purified from early postnatal rat retinae by immunopanning with antibodies against Thy1.1 and cultured in serum-free medium for two days. Cell survival was quantified by counting vital cells under phase-contrast optics. Results were normalized to controls. RGCs were treated with various concentrations (3.2 - 320 µM) of GBP-L with and without 1 µM glibenclamide, blocking both plasmalemmal and mitochondrial KATP channels, or 100 µM 5-hydroxydecanoate (5-HD), antagonizing selectively mitochondrial KATP channels. For comparison, additional cultures were treated with 32 µM gabapentin, the parent drug of GBP-L. A combination of neurotrophic factors BDNF plus CNTF (50 ng/ml each) served as a positive control.
Results: GBP-L increased RGC survival to a maximum of 145 ± 5% (mean ± SEM) in a concentration-dependent manner. The pEC50 was 5.0, CI95 [4.7, 5.3]. Preincubation with glibenclamide changed the dose-response of GBP-L, indicating that it acted as a competitive antagonist with a pA2 value of 6.8, CI95 [5.9, 7.5]. 5-HD completely blocked the survival-promoting effect of GBP-L. Gabapentin had no effect whereas the combination of CNTF plus BDNF enhanced survival to 177 ± 9%.
Conclusions: GBP-L, but not gabapentin, can promote the survival of cultured central nervous system neurons, eventually by opening mitochondrial KATP channels. These results suggest further testing of GBP-L as a potentially neuroprotective drug.


SWD-Schlagwörter: Zellkultur , Ratte , Neuroprotektivum , Neuropeptide , Neuropharmakologie , Neuroophthalmologie , Neuropharmakon , Nervendegeneration , Neuroanatomie
Freie Schlagwörter (englisch): neuroprotection , cell culture , retinal ganglion cell , neuropeptide
Institut: Univ.-Augenklinik
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Medizin und Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Lagrèze, Wolf -Dietrich A. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 06.09.2005
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