Direkt zum Inhalt | Direkt zur Navigation

Eingang zum Volltext

Lizenz

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-21295
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/2129/


Stahl, Andreas

Entwicklung eines in vitro Modellsystems zur Herstellung vaskularisierter Konstrukte für das Tissue Engineering von Knochen

Development of an in vitro model system for the creation of vascularized bone constructs for tissue engineering

Dokument1.pdf (49.670 KB) (md5sum: a556f50a2f28e8b8004d7de1c9efcf6c)

Kurzfassung in Deutsch

Die modernen Methoden des Tissue Engineering erlauben zunehmend einen klinischen Einsatz von in vitro generierten Gewebekonstrukten. Bei der Transplantation von dreidimensionalen Geweben stößt das klassische Tissue Engineering allerdings an seine Grenzen. Eine der wichtigsten Herausforderungen für das Tissue Engineering besteht in der Verbesserung der Durchblutung des in vitro vorgebildeten Gewebeersatzes. Eine mögliche Strategie zur Lösung dieser Aufgabe stellt dabei die in vitro-Integration eines vaskulären Plexus in das Gewebekonstrukt dar.
In dieser Arbeit wurde ein Modellsystem entwickelt, in welchem stromabildende Osteoblasten mit Blutgefäßzellen kokultiviert werden. In seiner Dreidimensionalität soll das Modellsystem dabei möglichst gut den späteren Anforderungen zum Gewebeersatz entsprechen. Zunächst konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass beide Zelltypen in einem Konstrukt kokultiviert werden können und lebensfähig sind. Allerdings verloren die Endothelzellen durch die Präsenz der Osteoblasten die Fähigkeit zur Ausbildung von kapillären Strukturen im Konstrukt. Ausgehend von dieser Beobachtung wurden verschiedene Interaktionswege der Osteoblasten und Endothelzellen molekularbiologisch untersucht. Dabei konnten sowohl auf Genexpressions- als auch auf Proteinebene differentiell regulierte Proteine der angiogenen Signaltransduktion gefunden werden, welche möglicherweise bei der beobachteten Hemmung der in vitro-Angiogenese eine wichtige Rolle spielen.
Um eine praktische Anwendbarkeit des vorgestellten Modellsystem im klinischen Kontext zu erreichen, muss die beschriebene Hemmung der osteoblasteninduzierten Hemmung der Angiogenese überwunden werden. Dies gelang im Rahmen der vorliegenden Arbeit im Mausmodell durch die Integration endothelialer Vorläuferzellen anstelle von reifen Endothelzellen. Die starke angiogene Potenz der Vorläuferzellen war in der Lage, trotz der Anwesenheit von Osteoblasten einen Gefäßplexus im Konstrukt auszubilden. Hieraus ergeben sich interessante Ansätze zur Entwicklung eines in vitro ausreichend vorvaskularisierten Gewebeersatzes, welche nach Fortführung und tierexperimenteller Validierung der hier vorgestellten Ergebnisse zu einem dreidimensionalen, vaskularisierten Knochenersatz für die klinische Anwendung führen könnten.


Kurzfassung in Englisch

One of the major challenges in tissue engineering of bone substitutes remains ascularization of the transplant. We have developed a three-dimensional collagen-based coculture system to assess interactions between human endothelial cells (hECs) and human osteoblasts (hOBs) in vitro. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown as three-dimensional multicellular spheroids and seeded in a collagen matrix to assess sprouting of the spheroids, that is, formation of tubelike structures resembling early capillaries. Direct cell contact between hOBs and HUVECs was established by incorporating hOBs into the EC spheroids, thus forming heterogeneous cospheroids. Spatial organization of cospheroids and sprout configuration were assessed by immunohistochemical wholemount staining techniques and confocal laser microscopy. Cumulative sprout length of spheroids was quantitatively analyzed by digital imaging planimetry. In this model HUVECs and hOBs formed heterogeneous cospheroids with distinct spatial organization. The ability of HUVEC spheroids to form tubelike structures on angiogenic stimulation with vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor was suppressed in heterogeneous HUVEC/hOB cospheroids. The model system introduced in this study may be useful to assess the mechanisms involved in regulating angiogenesis during bone formation and to further investigate the mechanisms by which heterotypic cell-cell interactions inhibit endothelial tube formation for applications in bone tissue engineering.

Multiple cell-cell interactions control bone morphogenesis and vascularization. We have employed a spheroidal coculture system of endothelial cells (EC) and osteoblasts (OB) to study cell contact-dependent gene regulation between these two cell types that may play a role in regulating OB differentiation and EC angiogenic properties. Coculture spheroids differentiate spontaneously to organize into a core of OB and a surface layer of endothelial cells. Individual spheroid culture of EC or OB leads to significant alterations in gene expression compared to standard monolayer culture (upregulation of Tie-2 in EC; upregulation of angiopoietin-2 in osteoblasts). More importantly, spheroidal coculture of endothelial cells and osteoblasts leads to significant changes of gene expression in both cell populations (upregulation of VEGFR-2 in EC; downregulation of VEGF, and upregulation of alkaline phosphatase in osteoblasts). These changes are dependent on cell-cell contact and are not seen in stimulation experiments with conditioned supernatants. Collectively, the data demonstrate complex bi-directional gene regulation mechanisms between EC and OB that are likely to play a critical role during OB differentiation and in controlling the properties of angiogenic EC.

Survival of tissue transplants generated in vitro is strongly limited by the slow process of graft vascularization in vivo. A method to enhance graft vascularization is to establish a primitive vascular plexus within the graft prior to transplantation. Endothelial cells (EC) cultured as multicellular spheroids within a collagen matrix form sprouts resembling angiogenesis in vitro. However, osteoblasts integrated into the graft suppress EC sprouting. This inhibition depends on direct cell-cell-interactions and is characteristic of mature ECs isolated from preexisting vessels. In contrast, sprouting of human blood endothelial progenitor cells is not inhibited by osteoblasts, making these cells suitable for tissue engineering of pre-vascularized bone grafts.


SWD-Schlagwörter: Angiogenese , Tissue Engineering , Knochen , Osteoblast , Endothel , Sphäroid
Freie Schlagwörter (englisch): angiogenesis , Tissue Engineering , bone , endothelial , osteoblast
Institut: Chirurgische Univ.-Klinik
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Medizin und Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Prof. Dr. G.B. Stark
Quelle: Tissue Eng. 2004 Sep-Oct;10(9-10):1536-47, Biochem Biophys Res Commun. 2004 Sep 17;322(2):684-92, FEBS Lett. 2005 Oct 10;579(24):5338-42
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.03.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 18.11.2005
Indexliste