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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-21373
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/2137/


Boll, Raija

Untersuchungen zur Biosynthese und Regulation von Oligosaccharid-Antibiotika

Studies on the biosynthesis and regulation of oligosaccharide antibiotics

Dokument1.pdf (886 KB) (md5sum: 1e811d06e8dd91936ee2214637f4b62e)

Kurzfassung in Deutsch

Avilamycine, gebildet von Streptomyces viridochromogenes Tü57, sind Oligosaccharid-antibiotika aus der Gruppe der Orthosomycine. Sie bestehen aus einer terminalen Dichloroisoeverninsäure, die esterglykosidisch mit einer linearen Heptasaccharidkette verknüpft ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation der Avilamycin-Biosynthese durch die beiden Regulatorgene aviC1 und aviC2 im Avilamycin-Biosynthesegencluster untersucht. Die Inaktivierung führte jeweils zum Zusammenbruch der Avilamycin-Biosynthese. Bei der Überexpression von aviC1 im Wildtyp wurde die Avilamycin-Biosynthese um das 4,6-fache gesteigert, bei gleichzeitiger Überexpression beider Regulatoren stieg die Avilamycin-Biosynthese um das 4,8-fache. Bei Überexpression von aviC2 sank die Avilamycin-Biosynthese im Vergleich zum Wildtyp jedoch auf die Hälfte. Weiterhin wurden drei Gene untersucht, von denen angenommen wurde, dass sie in die Biosynthese und Modifizierung der Saccharidkette von Avilamycin involviert sind. Die Inaktivierung von aviP, einer putativen Phosphatase, brachte keinen Einblick in dessen Funktion in der Biosynthese, die Avilamycin-Biosynthese war in der Mutante nicht beeinflusst. AviE2 konnte durch Geninaktivierung und nachfolgende heterologe Expression in E. coli als UDP-D-Glucuronsäure-Decarboxylase identifiziert werden, die in der Biosynthese der L-Lyxose die Decarboxylierung der UDP-D-Glucuronsäure zur UDP-D-Xylose katalysiert. Nach Inaktivierung von AviX12, einem Protein aus der Familie der Radical-SAM-Enzyme, kam es zur Bildung eines neuen Avilamycin-Derivats, Gavibamycin N1, das anstelle der Mannose eine Glucose enthält. Nach heterologer Expression in E. coli und Aufreinigung des Enzyms konnte gezeigt werden, dass AviX12 ein [3Fe-4S]-Cluster enthält.
Der zweite Teil der Arbeit beinhaltet die Klonierung eines Teils des Saccharomicin-Biosynthesegenclusters aus Saccharothrix espanaensis. Saccharomicin ist wie Avilamycin ein Oligosaccharid-Antibiotikum und besteht aus 17 Desoxyzuckern und einem aromatischen Anteil, einer Kaffeesäure, die über eine Amidbindung mit der Aminosulfonsäure Taurin verknüpft ist. Eine Cosmidbank des Genoms von Saccharothrix espanaensis wurde mit einer dTDP-D-Glucose-4,6-Dehydratase-Sonde gescreent und die hybridisierenden Cosmide wurden kartiert. Ein Cosmid wurde sequenziert. Bei der Analyse der Sequenz konnten Zuckerbiosynthesegene für die Rhamnose-Biosynthese sowie Glykosyltransferase-Gene identifiziert werden, die möglicherweise in die Saccharomicin-Biosynthese involviert sind.


Kurzfassung in Englisch

Avilamycins are oligosaccharid-antibiotics produced by Streptomyces viridochromogenes Tü57. They belong to the orthosomycin group of antibiotics and consist of a terminal dichloroisoeverninic acid moiety linked to a linear heptasaccharide chain. The pathway-specific regulation of the avilamycin biosynthesis by the putative transcriptional regulators AviC1 and AviC2 was investigated. Gene inactivation experiments led to a breakdown of avilamycin biosynthesis in the respective mutant strains. The introduction of aviC1 on an integrative plasmid into the wildtype strain led to 4.6 fold overproduction of the antibiotic in comparison to wildtype level, 4.8 fold avilamycin production was reached after overexpression of aviC1 and aviC2 together. In contrast after single overexpression of aviC2 only half of the wildtype avilamycin production could be detected.
Moreover, three further genes were investigated thought to be involved in biosynthesis and structural modification of the saccharide chain of avilamycin. Inactivation of aviP, a putative phosphatase, did not give any information about its function. Avilamycin biosynthesis was not affected in the resulting mutant strain. The results of a gene deletion experiment of aviE2 and following heterologous expression in E. coli clearly identified AviE2 as a UDP-D-glucuronic acid decarboxylase. AviE2 is involved in the biosynthesis of the L-lyxose moiety of avilamycin by oxidative decarboxylation of UDP-D-glucuronic acid to UDP-D-xylose. After inactivation of aviX12 a new avilamycin derivative was produced, named gavibamycin N1, which harbours a D-glucose instead of a D-mannose in the heptasaccharide chain. AviX12 shows in its amino acid sequence the motifs of the Radical-SAM family of proteins. After heterologous expression in E. coli and purification it could be shown, that AviX12 contains a [3Fe-4S] cluster characteristic for this enzyme family.
The second part of the work compromises the cloning of a part of the saccharomicin biosynthetic gene cluster from Saccharothrix espanaensis. Like avilamycin saccharomicin is an oligosaccharide antibiotic. It consists of 17 deoxysugar moieties linked to the small aglykone of caffeic acid bound to the amino sulfonic acid taurine. A cosmid library containing the genome of Saccharothrix espanaensis was screened with a dTDP-glucose 4,6-dehydratase as a probe. The hybridizing cosmids were analysed by restriction analysis. One cosmid was selected for sequencing. Sugar biosynthetic genes for L-rhamnose biosynthesis as well as glykosyltransferase genes could be detected in the resulting sequence which might be a part of the saccharomicin biosynthetic gene cluster.


SWD-Schlagwörter: Regulation , Avilamycin
Freie Schlagwörter (deutsch): Saccharomicin , Oligosaccharid-Antibiotika , Biosynthesegencluster
Freie Schlagwörter (englisch): avilamycin , saccharomicin , biosynthetic gene cluster , oligosaccharide antibiotics , regulation
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.10.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 18.11.2005
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