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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-21383
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/2138/


Bihlmaier, Corina

Polyenantibiotika aus Streptomyceten : molekularbiologische Untersuchungen zur Biosynthese von Simocyclinon und alpha-Lipomycin

Polyene antibiotics from streptomycetes : molecular biological investigations of the biosynthesis of simocyclinone and alpha-lipomycin

Dokument1.pdf (1.918 KB) (md5sum: cbd4426a446d33b6a9705d9158df580c)

Kurzfassung in Deutsch

In der vorliegenden Arbeit wurde die Biosynthese der Polyenantibiotika Simocyclinon D8 und alpha-Lipomycin untersucht.
Der Stamm S. antibioticus Tü6040 produziert als Hauptderivat Simocyclinon D8, ein natürliches Hybrid-Antibiotikum bestehend aus einem Angucyclinon, einer C-glykosidisch gebundenen D-Olivose, einer Tetraenseitenkette und einem Aminocumarin-Anteil. Je nach verwendetem Medium wird von dem Streptomyceten neben Simocyclinon D8 eine Anzahl weiterer Simocyclinone produziert. Die verschiedenen Simocyclinone unterscheiden sich zum einen durch ganze Strukturelemente voneinander und zum anderen durch Modifizierungen, wie die Acetylierung der D-Olivose an Position C-4 und die Halogenierung des Aminocumarins.
Für die Acetylierung der D-Olivose konnte durch heterologe Expression der Nachweis erbracht werden, dass SimB6 diesen Syntheseschritt katalysiert. Für weitere in vitro Untersuchungen wurde die Acetyltransferase SimB6 als His-Tag Protein löslich in E. coli BL21 (DE3) pLysS und S. fradiae AX exprimiert und aufgereinigt.
Die Einzigartigkeit der Struktur der Simocyclinone liegt in der Kombination des Polyens mit einem Dideoxyzucker und einem Aminocumarin begründet. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Synthese des Tetraens näher untersucht, das durch eine Typ I Polyketid-Synthase gebildet und im Zusammenspiel verschiedener Enzyme zur Tetraendisäure modifiziert wird. Durch Geninaktivierungsexperimente konnte die Beteiligung der Enzyme SimC4 und SimC5 an der Synthese der Tetraendisäure eindeutig nachgewiesen werden. Vermutlich katalysieren die putative Dioxygenase SimC4 und die putative Aldehyd-Dehydrogenase SimC5 die Oxidation zur Carboxylgruppe an Position C-10 des Polyketides.
Die gegen Gram-positive Bakterien biologisch aktive Substanz alpha-Lipomycin wird von S. aureofaciens Tü117 produziert. Sie besteht aus dem Polyenoyl-Tetramsäure Derivat beta-Lipomycin und dem O-glykosidisch verknüpften Dideoxyzucker D-Digitoxose.
Um die Biosynthese des Antibiotikums untersuchen zu können, wurde in der vorliegenden Arbeit das alpha-Lipomycin Biosynthese-Gencluster (lip-Cluster) auf den Cosmiden 52-3L13, 52-6I03, 52-5A16 und 52-1F15 einer Cosmid-Bibliothek der genomischen DNA des Stammes S. aureofaciens Tü117 identifiziert. Es wurden ca. 74 kb DNA dieser vier sich überlappenden Cosmide sequenziert. Nach Auswertung der Sequenzdaten konnten innerhalb des sequenzierten Bereiches 28 offene Leserahmen detektiert werden. Über Homologievergleiche wurde den meisten Genen eine putative Funktion zugeordnet und das lip-Cluster auf einen Bereich von ca. 67 kb mit 22 Genen eingegrenzt. Darunter finden sich Gene, deren Genprodukte vermutlich involviert sind in die Biosynthese von alpha-Lipomycin, die Regulation der Lipomycin-Biosynthese und die Ausbildung der Eigenresistenz des Produzenten.
Der Nachweis, dass es sich bei dem analysierten Bereich um das lip-Cluster handelt, wurde durch Geninaktivierungsexperimente erbracht. Dazu wurde für den Stamm S. aureofaciens Tü117 zunächst ein Transformations-Protokoll etabliert sowie ein Isolierungs- und Aufreinigungsprotokoll für die Substanz alpha-Lipomycin.
Insgesamt erfolgte in der vorliegenden Arbeit die Inaktivierung von fünf Genen (lipNrps, lipMt, lipPks, lipGtf und lipDig3) aus dem lip-Cluster.
Die phänotypische Charakterisierung der Mutanten mittels LC-MS Analytik zeigte eindeutig die Beteiligung von LipGtf und LipDig3 an der Biosynthese und Verknüpfung der D-Digitoxose. Bei LipGtf handelt es sich um die Glycosyltransferase, welche den Zucker auf das Aglykon überträgt. Mit weiterführenden Experimenten konnte klar gezeigt werden, dass LipDig3 stereospezifisch die 3-Ketogruppe von NDP-3,4-Diketo-2,6-Dideoxy-D-Glucose reduziert. Die Inaktivierung von lipNrps (nicht-ribosomale Peptid-Synthetase), lipMt (Methyltransferase) und lipPks (Polyketid-Synthase) führte zum Zusammenbruch der Lipomycin-Biosynthese. Dies spiegelt die frühe Beteiligung dieser Enzyme an der Biosynthese des Aglykons wider.
Basierend auf den Ergebnissen der Sequenzanalyse und der Geninaktivierungen wurde ein hypothetischer Biosyntheseweg für Lipomycin postuliert.


Kurzfassung in Englisch

The topic of this thesis is the biosynthesis of the polyene antibiotics simocyclinone D8 and alpha-lipomycin.
Simocyclinone D8, a natural multihybrid antibiotic, consists of four different moieties, an angucyclic polyketide core, a C-glycosidically linked D-olivose, a tetraene side chain, and an amino-coumarin. It is the main compound produced by S. antibioticus Tü6040, but the strain also produces other simocyclinones depending on the production media, which can be seen as intermediates of simocyclinone D8. These compounds differ in complete structural moieties and they also vary in modifications, like the acetylation of the D-olivose at position C-4 and the halogenation of the amino-coumarin.
Heterologous expression of SimB6 proved the function of this enzyme as acetyltransferase, catalyzing the modification of the D-olivose. For further in vitro studies the acetyltransferase SimB6 was isolated as soluble His-tag protein from E. coli BL21 (DE3) pLysS and S. fradiae AX.
The linkage of the polyene moiety on one side with a deoxysugar and on the other side with an amino-coumarin makes the structure of simocyclinone unique. This made the synthesis of the tetraene particularly interesting to research. To generate the polyene moiety, a type I polyketide synthase and additional enzymes involved in tailoring reactions are needed. In this study gene inactivation experiments could prove the importance of SimC4 (putative dioxygenase) and SimC5 (putative aldehyde dehydrogenase), supposed to catalyze the oxidation of the second carboxyl group at position C-10 of the polyketide.
The acyclic polyene antibiotic alpha-lipomycin is isolated from S. aureofaciens Tü117 and shows antibiotic activity against gram-positive bacteria, but has no effect upon the growth of fungi, yeast, and gram-negative bacteria. The metabolite consists of the aglycone beta-lipomycin, a polyenoyl tetramic acid derivative, and the O-glycosidically attached deoxysugar D-digitoxose.
To study the biosynthesis of this antibiotic, the entire biosynthetic gene cluster (lip-cluster) was identified on the four overlapping cosmids 52-3L13, 52-6I03, 52-5A16 and 52-1F15. DNA sequence analysis of a 74 kb region revealed the presence of 28 complete open reading frames (ORFs), 22 of them belonging to the biosynthetic gene cluster. Central to the cluster is a polyketide synthase locus that encodes an eight-module system comprised of four multifunctional proteins. In addition, one ORF shows homology to non-ribosomal peptide synthetases indicating that alpha-lipomycin belongs to hybrid peptide-polyketide natural products. Furthermore, the lip-cluster includes genes responsible for the formation and attachment of the D-digitoxose, as well as ORFs that resemble putative regulatory and export functions.
A total of five biosynthetic mutants were generated by insertional gene inactivation (lipNrps, lipMt, lipPks, lipGtf und lipDig3). Analysis of culture extracts of these mutants by LC-MS could prove that indeed LipGtf and LipDig3 are involved in the biosynthesis and attachment of D-digitoxose. LipGtf appears to be the glycosyltransferase, connecting the sugar with the aglycone. Further experiments showed that LipDig3 reduces stereospecifically the 3-keto group from NDP-3,4-diketo-2,6-dideoxy-D-glucose. LC-MS analysis of mutant strains with inactivated lipNrps (non-ribosomal peptide-synthetase), lipMt (methyltransferase) and lipPks (polyketide-synthase) showed that the biosynthesis of lipomycin was completely abolished, indicating the involvement in early steps of the aglycone biosynthesis.
A hypothetical biosynthetic pathway was proposed, based on the results of sequence analysis and gene inactivation experiments.


SWD-Schlagwörter: Streptomycetaceae
Freie Schlagwörter (deutsch): Polyenantibiotika , Simocyclinon , Lipomycin , Biosynthesegencluster , Polyketid
Freie Schlagwörter (englisch): polyene antibiotics , simocyclinone , lipomycin , biosynthetic gene cluster , polyketide
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.10.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 23.11.2005
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