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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-2274
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/227/


Schlemmer, Erika

Klonierung, Expression und funktionelle Charakterisierung eines Minirezeptors aus der Domäne II des LDL Receptor Related Protein

Cloning, expression and functional characterization of a minireceptor representing domain II of the ldl receptor related protein

Dokument1.pdf (4.058 KB) (md5sum: b478a7b197d6add2c1cf813a85c02b4a)

Kurzfassung in Deutsch

Das LDL Receptor Related Protein (LRP) ist ein 600 kD großer multifunktioneller Rezeptor, der in der Leber stark exprimiert wird und Liganden aus dem Lipidstoffwechsel bindet. Zu Beginn dieser Arbeit war die Lage der Bindungsstellen von Liganden des Lipidstoffwechsels im LRP nur unzureichend charakterisiert. Mit der Überexpression der Domäne II als membrangebundenem Minirezeptor in Säugerzellen sollte ein Modell entwickelt werden, mit dem in Zellkulturen die Rolle der Domäne II bei der Rezeptorbindung untersucht werden kann. Mit der Expression des Domäne II-Fragments im Baculoexpressionssystem sollte die Voraussetzung für eine spätere Strukturaufklärung dieser Domäne geschaffen werden.
Mit rekombinanten Baculoviren, die ein Konstrukt aus der LRP-Domäne II enthielten, konnte in Insektenzellen der lösliche LRP-Minirezeptor als 200 kD Protein exprimiert werden. Eine humane Zell-Linie mit stabiler Expression des LRP-Minirezeptorkonstruktes konnte etabliert werden. Das receptor associated protein (RAP) bindet an den Minirezeptor und kompetiert die Bindung anderer Liganden. Im Gegensatz zu früher beschriebenen Minirezeptorkonstrukten vermittelt der hier beschriebene Domäne II-Minirezeptor die zelluläre Aufnahme und Degradation von Alpha-2-Makroglobulin. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass der ApoE-Gehalt von VLDL aus dem Plasma normolipidämischer Personen ausreichend ist, um eine Bindung an die Domäne II des LRP zu vermitteln. Ebenfalls erstmals wurde Lipoprotein(a) als Ligand für die Domäne II des LRP identifiziert, die Ligandenbindung erfolgt spezifisch über das Apo(a).
Das Konstrukt aus der cDNA der Domäne II repräsentiert somit die vollständige funktionelle Einheit der zweiten ligandenbindenden Domäne des LRP. Die Optimierung der Baculoexpression dieses Konstruktes mit dem Ziel einer größeren Ausbeute der Expression soll in Zukunft


Kurzfassung in Englisch

The LDL-receptor related protein (LRP) is a multifunctional receptor strongly expressed in the liver which binds ligands of the lipid metabolism. At the beginning of this project the binding sites of ligands within the LRP were only insufficiently characterized. By overexpressing the domain II of LRP as a membrane bound minireceptor in mammalian cells a modell system should be created inabling the investigation of the role of this domain in ligand binding. The expression of the domain II protein fragment in the baculovirussystem should provide the prerequisite for future studies of the structure of this domain.
With recombinant baculoviruses containing a domain II construct, LRP mRNA and a 200 kDa protein was expressed in insect cells. The expression of this protein was independent of the coexpression of receptor associated protein (RAP).
A human cell-line with stable expression of the membranebound minireceptor was established. RAP was bound by the minireceptor and competed for receptorbinding with other ligands. In contrast to LRP minireceptors described earlier this domain II minireceptor mediated the binding, internalization, and cellular degradation of alpha-2-macroglobulin. It could be shown for the first time that the apolipoprotein E content of VLDL from normolipidemic plasma is sufficient for mediating the binding to domain II of the LRP. Furthermore lipoprotein (a) (lp (a)) was identified as a ligand for the domain II of the LRP. Binding of lp (a) to the minireceptor was mediated specifically by apolipoprotein (a).
The domain II cDNA construct represents the complete functional unit of the second ligandbinding domain of LRP. Improvements in the baculovirusexpression of the construct allowing a higher rate of yield will be the prerequisite for investigating the structure of the domain II and its spacer region. The newly established minireceptor cell-line provides a modell for the central functional unit of the LRP.


SWD-Schlagwörter: Überexpression , Lipoproteidstoffwechsel , Lipoprotein Lp (a) , Very-low-density-Lipoproteine , Membranrezeptor
Freie Schlagwörter (deutsch): LDL-receptor-related-protein LRP , receptor associated protein RAP , Minirezeptor , Alpha-2-Makroglobulin
Freie Schlagwörter (englisch): Alpha-2-macroglobulin , lipoprotein lp (a) , LDL-receptor-related-protein LRP , minireceptor , very-low-density-lipoproteins
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie (bis Sept. 2002)
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Neuhaus, Gunther (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.07.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 10.08.2001
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