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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-22800
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/2280/


Dürr, Clemens

Untersuchungen zur Phenalinolactonbiosynthese sowie Charakterisierung der ungewöhnlichen Glycosyltransferasen UrdGT2 und AviGT4

Investigation on phenalinolactone biosynthesis and characterisation of the unusual glycosyltransferases UrdGT2 and AviGT4

Dokument1.pdf (1.310 KB) (md5sum: 66139fb53e4781ffed54acdf6492b6a1)

Kurzfassung in Deutsch

Zusammenfassung der Dissertation "Untersuchungen zur Phenalinolactonbiosynthese sowie Charakterisierung der ungewöhnlichen Glycosyltransferasen UrdGT2 und AviGT4" von Clemens Dürr

Im Rahmen von drei Projekten wurden Untersuchungen zur Biosynthese glycosidierter Naturstoffe durchgeführt:

1) Phenalinolactone sind eine Gruppe antibiotisch wirksamer Terpenglycoside, die von dem grampositiven Bakterium Streptomyces sp. Tü6071 produziert werden. Die außergewöhnlich vielfältige Struktur der Phenalinolactone umfasst Bausteine unterschiedlicher Biosynthesewege. Der Grundkörper ist ein trizyklisches Terpen, welches mit einer 4-O-methylierten Trideoxyhexose (L-Amicetose), einer 5-Methylpyrrol-2-carbonsäure und mit einem Acetatrest substituiert ist. Das auffälligste Strukturelement ist ein hoch oxidiertes gamma-Butyrolacton, welches über eine C-C-Verknüpfung an den Trizyklus gebunden ist. In der vorliegenden Arbeit konnte das für die Biosynthese der Phenalinolactone erforderliche Gencluster auf dem Genom des Produzenten lokalisiert und sequenziert werden. Die Sequenzanalyse der Cluster-DNA erlaubte einen umfassenden Einblick in die genetische Organisation der Phenalinolactonbiosynthese. Damit war die Grundlage für die experimentelle Charakterisierung dieses Biosynthesewegs geschaffen. Durch gezielte Geninaktivierungen konnte die Funktion der C-21-Hydroxylase PlaO4, sowie der Amicetosyl-4-O-methyltransferase PlaM1 aufgeklärt werden. Hierbei konnte der überraschende Befund dokumentiert werden, dass ein Fehlen der O-Methylgruppe an 4-OH der Amicetose signifikante Veränderungen der NMR- Signale des gamma-Butyrolactons zur Folge hatte. Dies führt zur Hypothese einer intramolekularen Interaktion zwischen der frei gewordenen 4-OH-Funktion des Zuckerliganden und dem Halbacetal des gamma-Butyrolactons. Weiter konnte durch die Inaktivierung des Dioxygenasegens plaO1 ein erster Einblick in die Biogenese des gamma-Butyrolactons gewonnen werden. Die NMR-Strukturaufklärung des in der plaO1-Mutante akkumulierenden Derivats zeigte, dass das gamma-Butyrolacton aus einer linearen C-4-Seitenkette hervorgeht.

2) UrdGT2 ist eine gut untersuchte Glycosyltransferase aus dem Urdamycinproduzenten Streptomyces fradiae Tü2717, welche unter nativen Bedingungen eine Dideoxyhexose (D-Olivose) beta-C-glycosidisch an C-9 des Urdamycinaglykons knüpft. In vorangegangenen Untersuchungen wurde bereits gezeigt, dass UrdGT2 eine außergewöhnlich hohe Flexibilität sowohl bezüglich des zu übertragenden Zuckers, als auch bezüglich des Akzeptorsubstrats besitzt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass diese Flexibilität sogar den Modus der glycosidischen Bindung umfasst. Durch die UrdGT2-katalysierte Biotransformation des Akzeptormimetikums 1,2-Dihyroxyanthrachinon (Alizarin) zum 2-O-beta-D-Olivosyl-1,2-dihydroxyanthrachinon wurde erstmalig gezeigt, dass eine C-Glycosyltransferase auch O-glycosidische Bindungen etablieren kann. Dieses Resultat erlaubt erste Rückschlüsse auf den bislang unbekannten Mechanismus des aromatischen C-Glycosyltransfers.

3) Avilamycine, produziert von Streptomyces viridochromogenes Tü57, sind hochpotente Orthosomycin-Antibiotika. Sie bestehen aus einer aromatischen Säure (3,5-Dichlor-6-O-methylorsellinsäure) welche mit einer Heptasaccharidseitenkette verestert ist. Durch Inaktivierung des putativen Glycosyltransferasegens aviGT4 kam es zur Akkumulierung eines neuen Avilamycinderivats, welches mittels APCI/MS-Fragmentierungsanalyse als ein Avilamycin mit einer terminal verkürzten Saccharidseitenkette identifiziert werden konnte. Somit konnte mit AviGT4 die Glycosyltransferase gefunden werden, welche an der Ausbildung der ungewöhnlichen Orthoesterbindung zwischen den beiden endständigen Zuckerbausteinen (L-Lyxose und Eurekanat) beteiligt ist.


Kurzfassung in Englisch

Summary of the thesis "Untersuchungen zur Phenalinolactonbiosynthese sowie Charakterisierung der ungewöhnlichen Glycosyltransferasen UrdGT2 und AviGT4" by Clemens Dürr

Part 1:

Phenalinolactones are novel terpene glycosides with antibacterial activity. A striking structural feature is a highly oxidized gamma-butyrolactone of elusive biosynthetic origin. To investigate the genetic basis of the phenalinolactones biosynthesis we cloned and sequenced the corresponding gene cluster from the producer strain Streptomyces sp. Tü6071. Spanning a 42 kbp-region 35 candidate genes could be assigned to putatively encode biosynthetic, regulatory and resistance conferring functions. Targeted gene inactivations were carried out to specifically manipulate the phenalinolactone pathway. The inactivation of a sugar methyltransferase gene and a cytochrome P450 monoxygenase gene led to the production of novel phenalinolactone derivatives. The inactivation of a Fe(II)/alpha-ketoglutarate dependent dioxygenase gene disrupted the biosynthetic pathway within gamma-butyrolactone formation. The structure elucidation of the accumulating intermediate indicated that phosphoenolpyruvate is the biosynthetic precursor of the gamma-butyrolactone moiety.

Part 2:

UrdGT2 is a glycosyltransferase from the soil bacterium Streptomyces fradiae Tü2717, which catalyzes the critical C-glycosylation step during the biosynthesis of the antitumor drug urdamycin A. Specifically UrdGT2 transfers 2,6-dideoxy-D-glucose (D-olivose) from its NDP-donor to carbon 9 of a benz[a]anthraquinone-derived polyketide, to yield the beta-C-glycoside aquayamycin. To further examine the acceptor substrate flexibility of UrdGT2 feeding experiments were carried out. With the UrdGT2-dependent bioconversion of the substrate mimic 1,2-dihyroxyanthrachinone (alizarin) towards 2-O-beta-D-olivosyl-1,2-dihydroxyanthrachinone it was shown for the first time that a natural product C-glycosyltransferase is capable for O-glycosyltransfer as well. In addition to the mechanistic consequences, this finding may impact upon applied pharmaceutical chemistry, since UrdGT2 could potentially be harnessed as both a C- and O-GT.

Part 3:

The oligosaccharide antibiotic avilamycin A is produced by Streptomyces viridochromogenes Tü57. It is composed of a polyketide-derived dichloroisoverninic acid moiety attached to a heptasaccharide chain consisting of six hexoses and one unusual pentose moiety. Inactivation of aviGT4 resulted in a mutant that accumulated a novel avilamycin derivative. Based on APCI/MS fragmentation analyses this derivative could be identified as an avilamycin lacking the terminal sugar residue (eurekanate). Thus, AviGT4 is involved in the formation of the unusual orthoester linkage between the both terminal sugar residues (L-lyxose and eurekanate).


SWD-Schlagwörter: Biosynthese , Naturstoff , Streptomycetaceae , Glycosyltransferasen , Gencluster
Freie Schlagwörter (deutsch): Phenalinolacton , Avilamycin , Urdamycin , UrdGT2 , C-Glycosyltransfer
Freie Schlagwörter (englisch): phenalinolactone , avilamycin , urdamycin , UrdGT2 , C-glycosyltransfer
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.12.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 12.01.2006
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