Direkt zum Inhalt | Direkt zur Navigation

Eingang zum Volltext

Lizenz

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-23728
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/2372/


Radu, Ionela

FTIR Spectroscopy of the photophobic sensory rhodopsin II/transducer complex from natronabacterium pharaonis

FTIR Spektroskopie des photophbischen Sensory Rhodopsin II/ Transducer Complexes aus Ntronobacterium Pharaonis

Dokument1.pdf (8.908 KB) (md5sum: 7c1042baf2f0438bea9cbe0b1671ba8e)

Kurzfassung in Deutsch

Archaebakterielles Sensory Rhodopsin besitzt eine transmembrane Struktur bestehend aus sieben alpha Helices. Als Chromophor dient ein Retinalmolekül, das über eine protonierte Schiff´sche Base an das Protein gebunden ist. Dieses System ist exemplarisch für Signal Transduktion und stieß in den letzten Jahren auf immer größeres Interesse. Wird das Protein durch einfallendes Licht angeregt, er­folgt eine Photoisomerisation des Retinals von der all-trans zur 13-cis Konfiguration, welche Konfor­mationsänderungen hervorruft, die wiederum die entsprechenden Transducer­proteine aktivieren.
In der vorliegenden Arbeit wird die FTIR Spektroskopie als biophysikalische Methode zur Charakterisierung des Komplexes bestehend aus Sensory Rhodopsin II (SRII) aus Natronobacterium pharaonis und dem zugehörigen Transducer (HtrII) verwendet. Hierbei wurde eine neue Art der Probenpräparation angewendet. Diese so genannten Sandwich-Proben scheinen besser geeignet für die Untersuchung des Komplexes zu sein, da sie native Hydratationsbedingungen der Proteine gewährleisten.
Sowohl statische als auch zeitaufgelöste Messungen wurden für diese Arbeit durchgeführt. Da es sich als schwierig herausstellte, sowohl bei statischen Messungen bei Raumtemperatur als auch bei step-scan Messungen zuverlässige Daten zu erhalten, wurden die Untersuchungen auf niedrige Temperatu­ren (K-Intermediate) und rapid-scan Messungen (M2-Intermediat) beschränkt.
Von Hauptinteresse war das Aufspüren von Konformationsänderungen, die beim Rezeptor und Trans­ducer während der Bildung des späten M-Intermediates auftreten. Der molerkulare Mechanismus der M1-M2 Konversion wurde durch unsere vorausgegangenen FTIR-Experimente offenkundig. Sie um­fassen ausschließlich Konformationsänderungen des Proteins, die sich in veränderten Amid I/II Schwingungen äußern.
Eine weitere interessante Fragestellung betrifft die Signalweiterleitung entlang des cytoplasmatischen Teils des Transducers bis zur Aktivierungsdomäne. In diesem Zusammenhang wird angenommen, dass hierbei die Linker-Region (HAMP) in der Nähe der Membran eine Schlüsselrolle einnimmt. Da­her wurden Spektren des Rezeptors mit denen von Komplexen mit unterschiedlich langen C-termina­len Enden (bis Position 114 und 157) verglichen .
Sowohl K- als auch M-Intermediat Spektren des Komplexes sind sich überraschenderweise sehr ähn­lich den des Rezeptors, was darauf hindeutet, dass die Banden überwiegend Veränderungen des Rezeptors während des Photozyklus aufzeigen. Für die Interpretation der Infrarot Differenzsspektren ist es erforderlich, zwi­schen Veränderungen des Transducers und des Rezeptors zu unterscheiden. Daher war es notwendig, Experimente mit Isotopen markierten Proteinen durchzuführen, um die Banden zu verschieben.
Die Differenz-Spektren der Komplexe, bei denen die Transducer Fragmente vollständig 13C, 15N mar­kiert waren, zeigten keine signifikant verschobenen Banden. Im Amid I und II Bereich wiesen die Spektren dennoch einige Unterschiede auf, die den Einfluss des Transducers auf den Rezeptor bele­gen.
Da die Banden der Differenzspektren des Komplexes hauptsächlich vom Rezeptor herrühren, ist eine Isotopenmarkierung des Rezeptors die Erfolg versprechende Strategie zur Identifikation der Banden des Transducers. Die Verschiebung der Amid I Banden führte zu einer verbesserten spekt­ralen Transmission, woraufhin wir diese Spektren von Proteinen mit markierten Rezeptor als Standard betrachteten. Die Ähnlichkeit der Rez_lab/TransX_wt minus Rez_lab Doppeldifferenzspektren ist ein Hinweis auf ähnliche strukturelle Veränderungen des Rezeptors in den beiden Komplexen, die inten­siveren Banden des Rez_lab/Trans157_wt Spektrums könnten auf eine festere Bindung des längeren Transducers mit dem Rezeptor hindeuten. Trotz dieser grundsätzlichen Gemeinsamkeiten sind drei Banden ausschließlich charakteristisch für das Rez_lab/Tran157_wt minus Rez-lab Spektrum, die offenbar zum Transducer Fragment zuzuordnen sind. Es ist schwierig, präzise molekulare Interpretationen für die Herkunft der drei Banden zu treffen, aber sie könnten mit strukturellen Verän­derungen verknüpft sein, die durch die Signalweiterleitung entlang der aktivierten TM2-Helix durch das HAMP-Segment bis hin zur cytoplasmatischen Adaptionsdomäne verursacht werden.


Kurzfassung in Englisch

Archaebacterial sensory rhodopsins possess a seven-transmembrane helical architecture and a retinal molecule bound to protein through a protonated Schiff base linkage, serving as chromophore. They can be considered as archetypes for signal transduction and received a growing interest in the last years. On light excitation the photoisomerization of the retinal to 13?cis configuration triggers conformational changes which result in the activation of the cognate transducer proteins.
In the present work, FTIR spectroscopy is exploited as a powerful biophysical tool for the analysis of the complex between sensory rhodopsin II (SRII) from Natronobacterium pharaonis and its transducer (HtrII). We adopted a new type of infrared samples, the so-called sandwich-sample, which seemed to be more amenable for the investigation of the complex, as quarantees native hydration conditions of the proteins.
Both static and time-resolved FTIR methods were used in this investigation. Nevertheless, room temperature steady-state and step-scan measurements presented some inconveniences in yielding reliable data. Thus we restricted the study to low-temperature (K intermediate) and rapid-scan (M2 intermediate) spectra.
Of major interest was the detection of conformation changes which occur on receptor and transducer during the formation of the late M intermediate. The molecular nature of the M1-to-M2 conversion was revealed by our previous FTIR experiments with film samples, and involves only distortions of the protein, described by altered amide I/II vibrations.
Another question to be addressed is the elucidation of structural changes which are the basis of signal conveyance along the cytoplasmic part of the transducer down to the activation domain. In this respect, it is suggested that the key role is played by the linker region (HAMP) in the vicinity of membrane. Thus, we made comparisons between spectra of the receptor and of complexes with two different C-terminally truncated transducers ( up to positions 114 and 157).
Both K and M intermediate difference spectra of the complex proteins were surprisingly similar, hinting that the bands predominantly described alterations of the receptor during the photoreaction. The interpretation of the infrared difference spectra requires to differentiate between receptor and transducer changes. Thus, it was necessary to performe experiments with isotope labelled proteins in order to shift the bands.
The difference spectra of complexes for which the transducer fragments were fully 13C, 15N labelled did not present significant shifted bands. However, the spectra underwent some deviations in amide I and II ranges, which proved to be influences of the transducer on receptor.
Since the difference spectra of the complexes mainly exhibit bands of the receptor, a more successful strategy for the identification of the transducer bands would result from receptor labelling. The shift of amide I bands resulted in an improved spectral transmission and thus, we considered the spectra of the proteins with labelled receptor as standard. The similarity of rec_lab/transX_wt minus receptor_lab double difference spectra is an indication for structural changes of the same pattern on the receptor in the two complexes, but the more intense bands in rec_lab/trans157_wt minus receptor_lab spectrum could indicate a tighter receptor-long transducer interaction. In spite of this general similarity, three bands are only characteristic for the rec_lab/trans157_wt minus receptor_lab spectrum, and they seem to belong to the transducer fragment. Their precise molecular interpretation is difficult to judge, but they could be associated to structural changes induced by the signal conveyance along the activated TM2 helix through the HAMP segment down to the cytoplasmic adaptation domain.


SWD-Schlagwörter: FT-IR-Spektroskopie , Retinalproteine
Freie Schlagwörter (deutsch): Sensor Rhodopsin II , Transducer , Hotozyklus
Freie Schlagwörter (englisch): photoreceptor , FTIR spectroscopy , rapid-scan
Institut: Institut für Physikalische Chemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Gräber, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.02.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 01.03.2006
Indexliste