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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-23830
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/2383/


Wolf, Philipp

Herstellung und Charakterisierung rekombinanter Immunotoxine aus anti-PSMA single-chain Antikörperfragmenten zur Therapie des Prostatakarzinoms

Generation and characterisation of recombinant immunotoxins from anti-PSMA single-chain antibody fragments for prostate cancer therapy

Dokument1.pdf (2.173 KB) (md5sum: 8f0a5ac9d904f4ad674df8b67c7f9a9d)

Kurzfassung in Deutsch

In westlichen Industrienationen stellt das Prostatakarzinom das häufigste Karzinom und die zweithäufigste Krebs-Todesursache beim Mann dar. Das Hauptproblem bei der Therapie dieses Karzinoms stellen aggressiv wachsende, hormonresistente Tumore dar, die nach operativer Entfernung der Prostata eine Progression erfahren und die auf keine bisher existierende Therapie ansprechen. Deshalb besteht dringender Handlungsbedarf bezüglich neuer Wirkstoffe, die eine gezielte Behandlung dieses Karzinoms ermöglichen.
Das Prostataspezifische Membranantigen (PSMA), welches als Dimer an der Oberfläche von Prostata-Epithelialzellen vorliegt, stellt ein hervorragendes Zielantigen für eine Prostatakarzinom-Therapie dar, denn es ist a) hauptsächlich in der Prostata exprimiert, b) in hohem Maße als Protein in allen Stadien des Tumors vorhanden, c) im androgen-sensitiven und metastasierten Karzinom stark hochreguliert, d) mit einer Enzymaktivität assoziiert und wird e) an der Zelloberfläche präsentiert und nicht in den Blutkreislauf abgegeben. Deshalb könnte eine spezifische Immuntherapie eine Alternative zur Bekämpfung dieses Tumors darstellen.
Nach Immunisierung einer Balb/c-Maus mit nativem PSMA konnten drei monoklonale Antikörper (3A12, 3E7, 3F11) gewonnen werden, die einerseits mit dem isolierten Antigen reagierten, andererseits auch eine starke und spezifische Bindung an viable PSMA-exprimierende LNCaP-Zellen und an mit PSMA transfizierten Zellen zeigten. Zudem konnte die Internalisierung in LNCaP-Zellen nachgewiesen werden.
Aus dem monoklonalen Antikörper 3A12 wurde zudem ein single-chain-Antikörperfragment (scFv) rekombinant hergestellt. Das scFv, A5 genannt, konnte durch Anwendung der Phage-Display-Technik und durch direkte Selektionierung auf antigen-tragenden Zellen gewonnen werden. A5 wies die gleichen Bindungs-Charakteristika wie sein parentaler Antikörper auf und zeigte eine Internalisierung in LNCaP-Zellen, allerdings in geringerem Ausmaß, was vermutlich auf seine monovalente Bindung an das Antigen zurückzuführen ist. A5 stellt damit das erste scFv dar, welches spezifisch an zelluläres PSMA bindet.
Die Daten zeigen, dass die drei monoklonalen Antikörper und das scFv A5 die Voraussetzungen als Agentien für ein antigen-basiertes Imaging und für eine Imuntherapie des Prostatakarzinoms optimal erfüllen.
Zur Konstruktion eines anti-PSMA-Immunotoxins wurde das scFv A5 rekombinant an eine verkürzte Form des Pseudomonas Exotoxin A (PE40) gekoppelt, dem die in der Natur vorkommende Zellbindungsdomäne Ia fehlt. Diese wurde durch A5 ersetzt, was zu einer Spezifität gegenüber PSMA-exprimierenden Zellen führte.
Das bakteriell exprimierte und aufgereinigte Immunotoxin A5-PE40 bindet spezifisch an PSMA-positive Prostatakarzinom-Zellen. In diesen konnte eine 50%ige Reduktion der Zellviabilität (IC50) bei einer Immunotoxin-Konzentration von 21 pM gemessen werden, während PSMA-negative Zellen nicht geschädigt wurden.
Aufgrund seiner hohen und spezifischen Toxizität stellt dieses rekombinante Immunotoxin einen vielversprechenden Kandidaten als Therapeutikum für Prostatakrebs-Patienten dar.



Kurzfassung in Englisch

Prostate cancer is the most commonly diagnosed form of cancer and the second leading cancer-related death among men in the Western civilisation. The main problem are aggressively growing, hormone-resistant tumors, which undergo progression after radical prostatectomy and which do not respond effectively to existing therapies. Therefore, there is an urgent need for new agents for targeted treatment strategies.
Prostate specific membrane antigen (PSMA), expressed as dimer on the surface of prostate epithelial cells, represents an excellent target for prostate cancer therapy, because it is i) primarily expressed in the prostate, ii) abundantly expressed as protein at all stages, iii) upregulated in androgen-insensitive or metastatic disease, iv) associated with enzymatic activity and v) presented at the cell surface but not released into the circulation. Therefore, specific immunotherapy may be a novel therapeutic option for the management of this tumor.
We obtained three monoclonal antibodies (3A12, 3E7 and 3F11) from a Balb/c-mouse immunized with native PSMA, which were reactive with the isolated antigen, also showing a strong and specific binding to viable PSMA-expressing LNCaP cells and PSMA-transfected cells. Additionally, internalisation in LNCaP cells could be demonstrated.
We also constructed a recombinant single-chain antibody fragment (scFv) against cell-adherent PSMA from the monoclonal antibody 3A12. The scFv, called A5, was obtained by phage display technology and direct selection on cells carrying the antigen. A5 exhibited the same binding characteristics like its parental antibody and showed internalisation in LNCaP cells, however to a lower extend, presumably due to its monovalent binding property. A5 represents the first scFv, binding specifically to cellular PSMA.
From these data it is concluded that the three monoclonal antibodies and the scFv A5 raised with native PSMA optimally fulfill the requirements as agents for antigen-based imaging and immunotherapy of prostate cancer.
For anti-PSMA immunotoxin construction the scFv A5 was genetically linked to a truncated form of Pseudomonas exotoxin A (PE40) lacking the naturally occuring cell binding domain Ia. This domain was replaced by the scFv, thus conferring specificity restricted to PSMA-expressing cells.
The bacterially expressed and purified immunotoxin A5-PE40 specifically binds to PSMA-positive prostate cancer cells. In these cells a 50 % reduction of viability (IC50) was found at an immunotoxin concentration of 21 pM, while PSMA-negative cells remained unaffected.
Due to its high and specific toxicity this recombinant immunotoxin is a promising candidate for potential therapeutic applications in patients with prostate cancer.


SWD-Schlagwörter: Immunotoxin , Hormonrefraktärer Prostatakrebs , Immuntherapie , Antikörper
Freie Schlagwörter (deutsch): Prostataspezifisches Membranantigen , PSMA , Antikörperfragment , scFv
Freie Schlagwörter (englisch): immunotoxin , immuntherapy , prostate cancer , PSMA , scFv
Institut: Chirurgische Univ.-Klinik
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Neuhaus, Gunther (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.02.2006
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 14.03.2006
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