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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-23899
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/2389/


Stern-Sträter, Jens

Tissue Engineering von Skelettmuskulatur : Vergleich eines in vitro und in vivo Ansatzes

Tissue engineering of skeletal muscle : comparison of an in vitro and in vivo approach

Dokument1.pdf (2.586 KB) (md5sum: b512deef83a6a5b8b80807a02b919c5e)

Kurzfassung in Deutsch

Neue Ansätze, um Muskeldefekte bei angeborenen und erworbenen Erkrankungen der Skelettmuskulatur im Sinne des Tissue Engineering zu therapieren, könnten in der Implantation von in vitro generiertem, differenziertem Skelettmuskelgewebe oder in der Injektion von Satellitenzellen oder anderen Muskelvorläuferzellen (Stammzellen) in die erkrankten Gewebeanteile bestehen, um anschließend die Formierung von funktionellem Muskelgewebe zu erreichen.
Im ersten Ansatz der vorliegenden Arbeit wurde versucht mit Hilfe der Elektrostimulation von Muskelvorläuferzellen in einer 3D-Fibrinmatrix die Differenzierung der Zellen zu etablieren und zu untersuchen. Vorteil dieser Methode gegenüber bisherigen Differenzierungsstimuli (neuronales Gewebe, Matrigel®) ist, dass sie im klinischen Bereich Anwendung finden könnte. Als Differenzierungsmarker dienten die Transkriptionsfaktoren der Myogenese MyoD und Myogenin als auch die Expression der Epsilon-Untereinheit des adulten Azetylcholinrezeptors.
Zunächst wurde die Genexpression der Muskelvorläuferzellen in 2D-Zellkultur und 3D-Fibrinkultur untersucht und verglichen, dabei konnte festgestellt werden, dass sich MyoD und Myogenin in der 3D-Kultur im Gegensatz zur 2D-Kultur stets nachweisen lassen. Die Azetylcholinrezeptoruntereinheit-Epsilon konnte sowohl in der 2D als auch in der 3D-Kultur nachgewiesen werden. Da Fibrin allein nicht zur Differenzierung von Myoblasten zu kontraktilen Myofibrillen ausreicht, wurde über eine Genexpressions- und Proteinanalyse der Einfluss der Elektrostimulation, die sich für die Zelldifferenzierung in 2D-Kulturen als aussichtsreich darstellte, an Myoblasten in einer 3D-Fibrin-Matrix untersucht. Als Ergebnis lässt sich festhalten, dass die Elektrostimulation tendenziell die Expression von MyoD, Myogenin und der Azetylcholinrezeptoruntereinheit-Epsilon herunterreguliert. Die Proteinform der Differenzierungsmarker konnte in den Myoblasten nicht nachgewiesen werden. Auch Trisk 51, ein Komplex des Ryanodin-Triadin-Rezeptors des sarkoplasmatischen Retikulums, sowie die embryonale Isoform der Myosin-Schwerkette (MHC) wurden nicht exprimiert. Alle diese Versuche wurden mit hoch und niedrig passagierten Myoblasten (P2 versus P4) durchgeführt und analysiert, wobei tendenziell in niedrig passagierten Myoblasten die Differenzierungsinduktion, die anhand der Expressionswerte ermittelt wurde, als leichter angesehen werden kann.
Im zweiten Ansatz dieser Arbeit wurden Myoblastensuspensionen innerhalb einer dreidimensionalen in-situ sich ausformenden Fibrinmatrix mit Hilfe einer Zweikanal-Spritze (Duploject® Spritzensystem) in Muskeldefekte von 24 syngenen Ratten appliziert. Das Überlebensschicksal der primären Myoblasten wurde anhand eines trans-gender Modells verfolgt, wobei männliche Myoblasten auf weibliche Tiere transplantiert wurden und das Y-Chromosom als Marker fungierte. Die Integrationsraten der Zellen wurden nach zwei Tagen und zwei, sechs und zwölf Wochen nach der Transplantation mittels ISH ermittelt und mit sieben Tagen vorkultivierten Myoblasten-Fibrin Konstrukten verglichen. Nach der Injektion behielten die Zellen ihren myogenen Phänotyp (Anti-Desmin Färbung positiv) und es gab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Integrationsraten im Vergleich zu sieben Tagen vorkultivierten Konstrukten.


Kurzfassung in Englisch

Several focal skeletal muscle diseases, including tumours and trauma lead to a limited loss of functional muscle tissue. There is still no suitable clinical approach for treating such defects. A promising approach could be the in vitro and in vivo tissue engineering approach of skeletal muscle which are compared in this study.
In the in vitro approach, a clinically reliable differentiation stimulus for three-dimensional (3-D) cultures is necessary for this process, and this condition has not yet been established. In order to quantify and analyze the differentiation potential of electrical cell stimulation, primary myoblasts were stimulated within a 3-D fibrin-matrix. Gene expression of MyoD, myogenin and AChR-Epsilon were measured by real-time RT-PCR over a time period of eight days, showing immediate down-regulation of all marker genes. For tissue engineering approaches, cell multiplication is crucial for acquisition of sufficient tissue volumes for reconstruction. Therefore, all experiments were performed with high and low passaged myoblasts, demonstrating higher transcript rates of marker genes in low-passage cells. Our findings strongly suggest a reconsideration of electrical stimulation in muscle tissue engineering.
In the in vivo approach we injected expanded primary male myoblasts into muscle defects in female syngeneic rats using the two-way syringe (Duploject®) within a 3D-fibrin matrix. Detection and evaluation were performed using Y chromosome in situ hybridisation (Y-ISH), anti-desmin immunostaining and H&E staining. To identify possible differences by means of integration, the injected myoblasts were compared to seven days of precultivated constructs.
Injected myoblasts showed increasing integration into host muscle fibres in a time-dependent manner, exclusively at the injection site. Anti-desmin staining revealed a conserved myogenic phenotype of transplanted cells. The fibrin matrix resolved over the period of 12 weeks with no indication of an inflammatory reaction. No significant difference in the number of detected Y chromosome-positive nuclei was found between the two transplantation groups.
The presented technique of myoblast-fibrin injection indicates a clinical potential for reconstruction of skeletal muscle defects in vivo using a ready-to-use device in combination with tissue engineering methods.


SWD-Schlagwörter: Tissue Engineering , Muskel , Zellkultur , Elektrostimulation , Differenzierung , In-situ-Hybridisierung , Fibrin
Freie Schlagwörter (englisch): tissue engineering , skeletal muscle , differentiation , electrical stimulation
Institut: Chirurgische Univ.-Klinik
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Medizin und Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Stark, Björn (Prof. Dr.)
Quelle: J.Cell. Mol. Med.
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 28.03.2006
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