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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-29955
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/2995/


Schleberger, Christian

Strukturanalyse des binären Toxins C2 aus Clostridium botulinum, von Protease Inhibitor Komplexen und der 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin-Hydrolase aus Arthrobacter nicotinovorans

Structure analyses of the binary Toxin C2 from Clostridium botulinum, protease inhibitor complexes and the 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynicotin-Hydrolase from Arthrobacter nicotinovorans

Dokument1.pdf (10.443 KB) (md5sum: 0e46184bfcbe476212c781cb6bb97f87)

Kurzfassung in Deutsch

Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Kristallstrukturen der enzymatisch aktiven Komponente als auch der Transportkomponente des C2-Toxins aus Clostridium botulinum bestimmt werden. Die enzymatisch aktive Komponente C2-I ist eine ADP-Ribosyltransferase (ART), die in der Lage ist, Aktin in der Wirtszelle zu ribosylieren, was letztendlich zur Depolymerisation des Zytoskeletts und somit zum Zelltod führt. Die Kristallisation von C2-I gelang nach der Einführung von Oberflächenmutationen, die anhand von Sekundär¬struktur¬vorhersagen geplant wurden. Die bei zwei verschiedenen Oberflächenmutanten gefunden Kristal¬lisations¬bedingungen spiegeln zwei physiologisch wichtige pH-Bereiche wider. Es konnte gezeigt werden, dass im niedrigen pH Bereich das Enzym eine hohe Stabilität aufweist und keinesfalls an struktureller Integrität einbüßt. Dies zeigt, dass die für den Transport benötigte Auffaltung von C2-I durch die pH-Verschiebung allenfalls begünstigt wird, jedoch hauptsächlich von Wechselwirkungen mit der heptameren Pore des aktivierten C2-II (C2-IIa) abhängt. Weiterhin wurde die unterschiedliche Aktivität von C2-I und vom verwandten Iota Toxin gegenüber verschiedenen Aktin-Isoformen untersucht. Anhand struktureller Vergleiche wurde eine Punktmutation am C2-I durchgeführt, die eine erhöhte Aktivität ergab, welche allerdings weiterhin geringer war als die des Iota-Toxins. Mit C2-II wurden Kristalle hergestellt, von denen ein Datensatz mittlerer Qualität gesammelt werden konnte. Es wurde eine Phasierung mit der Methode des molekularen Ersatzes durchgeführt, jedoch konnte das erhaltene Modell aufgrund der Datenlage nicht weiter verfeinert werden.
Für die Protease-Inhibitoren Scyptolin-A und Microginin-FR1 wurden die Kristallstrukturen im Komplex mit ihren jeweiligen Zielenzymen Elastase und cytosolischer Leucinaminopeptidase (LAP) bestimmt. Scyptolin-A enthält die ungewöhnliche Aminosäure Ahp (3-Amino-6-hydroxy-2-piperidon) und besitzt eine makrozyklische Struktur. Ahp besetzt im aktiven Zentrum die Stelle, an der sonst ein für die Katalyse wichtiges Wasser sitzt und verhindert so die Hydrolyse des Inhibitors. Die starke Bindung an Elastase wird durch eine substratähnliche Struktur erreicht, die optimal an das aktive Zentrum angepasst ist. Microgenin-FR1 zeichnet sich durch die lipidische N-terminale β-Aminosäure Ahda (3-Amino-2-hydroxy-decansäure) aus. Aus der Komplexstrukur mit LAP zeigt sich, dass die Bindung von Microgenin-FR1 der Bindung von Bestatin und Amastatin ähnelt. Anhand der erst kürzlich erschienen Struktur von mikrosomaler LAP im Komplex mit Bestatin ist zu vermuten, dass Ahda der entscheidende Faktor für die besseren Bindungseigenschaften von Microgenin-FR1 an microsomaler LAP ist.
Die Kristallstruktur der 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin-Hydrolase aus Arthrobacter nicotinovorans (DHPON-H) wurde durch den Einsatz eines Selenomethionin-Derivates bestimmt. Diese Hydrolase katalysiert die Spaltung von DHPON in die Komponenten 2,6-Dihydroxypyridin und γ-N-methyl-aminobutyrat. Hierbei wird die C-C Bindung zwischen dem Aromaten und der Seitenkette gespalten, was auch als Retro-Friedel-Crafts-Acylierung beschrieben werden kann. Die Strukturbestimmung ergab, dass das Enzym eine klassische α/β-Hydrolase Faltung besitzt und auch die typische katalytische Triade aufweist. Im Gegensatz zu den bisher bekannten Strukturen von C-C Bindung spaltenden Enzymen wurde jedoch eine α-helikale N-terminale Domäne gefunden, die sowohl an der Reaktion als auch an der Dimerisierung beteiligt ist. Da es nicht möglich war, eine Substratbindungsstruktur zu analysieren, wurde ein Modell für die Substratbindung erstellt, das anschließend durch Aktivitätsmutanten überprüft wurde. Anhand der Ergebnisse und der Position des Oxyanionenlochs konnte ein relativ sicheres Modell der Substratbindung vorgeschlagen werden. Zusätzlich wurden im Kristall zwei verschiedene Zustände des Enzyms gefunden, die als offen und geschlossen bezeichnet werden können. Unter Beachtung der von anderen C-C Bindung spaltenden Enzymen bekannten Daten wurde ein Vorschlag für den Reaktionsmechanismus erstellt.


Kurzfassung in Englisch

C2 toxin from Clostridium botulinum is composed of the enzyme component C2-I, which ADP-ribosylates actin, and the binding and translocation component C2-II, responsible for the interaction with eukaryotic cell receptors and the following endocytosis. Three C2-I crystal structures at resolutions of up to 1.75 Å are presented together with a crystal structure of C2-II at an appreciably lower resolution and a model of the prepore formed by fragment C2-IIa. The C2-I structure was determined at pH 3.0 and at pH 6.1. The structural differences are small, indicating that C2-I does not disintegrate, even at a pH value as low as 3.0. The ADP-ribosyl transferase activity of C2-I was determined for - and /-actin and related to that of Iota toxin and of a mutant intermediate between C2 and Iota. The structure of the transport component C2-II at pH 4.3 was established by molecular replacement using a model of the protective antigen of anthrax toxin at pH 6.0. The C-terminal receptor-binding domain of C2-II could not be located but was present in the crystals. A model of the C2-IIa prepore structure was constructed based on the corresponding assembly of the protective antigen. It revealed a surprisingly large number of asparagines lining the pore. The interaction between C2-I and C2-IIa and the translocation of C2-I into the target cell is discussed.
Natural bioactive compunds are of general interest to pharmaceutical research because they may be used as leads in drug development campaigns. Here the crystal structure of microginin FR1 from Microcystis sp. bound to bovine lens leucine aminopeptidase as well as the crystal structure of scyptolin A bound to pancreatic elastase was established. The observed binding structures could be beneficial for the design of potent aminopeptidase and elastase inhibitors, respectively.
The enzyme 2,6-dihydroxy-pseudo-oxynicotine hydrolase from the nicotine-degradation pathway of Arthrobacter nicotinovorans was crystallized and the structure was determined by an X-ray diffraction analysis at 2.1 Å resolution. The enzyme belongs to the /-hydrolase family as derived from the chainfold and from the presence of a catalytic triad with its oxyanion hole at the common position. This relationship assigns a pocket lined by the catalytic triad as the active center. The asymmetric unit contains two C2-symmetric dimer molecules, each adopting a specific conformation. One dimer forms a more spacious active center pocket and the other a smaller one, suggesting an induced-fit. All of the currently established C-C bond cleaving /-hydrolases are from bacterial meta-cleavage pathways for the degradation of aromatic compounds and cover their active center with a 40-residue lid placed between two adjacent strands of the -sheet. In contrast, the reported enzyme shields its active center with a 110-residue N-terminal domain, which is absent in the meta-cleavage hydrolases. Since neither the substrate nor an analogue could be bound in the crystals, the substrate was modeled into the active center using the oxyanion hole as a geometric constraint. The model was supported by enzymatic activity data of eleven point mutants and by the two dimer conformations suggesting an induced-fit. Moreover, the model assigned a major role for the large N-terminal domain that is specific to the reported enzyme. The proposal is consistent with the known data for the meta-cleavage hydrolases although it differs in that the reaction does not release alkenes but a hetero-aromatic compound in a retro-Friedel-Crafts acylation. Because the hydrolytic water molecule can be assigned to a geometrically suitable site that can be occupied in the presence of the substrate, the catalytic triad may not form a covalent acyl-enzyme intermediate but merely support a direct hydrolysis.


SWD-Schlagwörter: Strukturaufklärung , Kristallstrukturanalyse , Botulinus-C2-Toxin , Pankreaselastase , Alanyl-Aminopeptidase , Enzyminhibitor , Nicotin , Arthrobacter
Freie Schlagwörter (deutsch): Retro-Friedel-Crafts-Acylierung
Freie Schlagwörter (englisch): ADP-ribosylation , elastase inhibitor , leucine aminopeptidase , meta-cleavage pathway , X-ray diffraction analysis
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schulz, Georg E. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.04.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 07.05.2007
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