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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-30201
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/3020/


Berke, Jan Martin

Determinants for membrane association of the hepatitis C virus NS3-4A complex

Determinanten der Membranassoziation des Hepatitis C Virus NS3-4A Komplexes

Dokument1.pdf (5.348 KB) (md5sum: 8ec425db653fa88aaa6566f58f083a07)

Kurzfassung in Englisch

In this study the membrane association mechanism of the HCV NS3-4A complex and the topology of the NS4A protein was investigated. Fluorescence microscopy and membrane flotation analyses revealed that the N-terminal 21 aa represent the membrane anchor of the NS4A protein and it was demonstrated by glycosylation mapping that the N-terminus of the NS4A membrane anchor traverses the membrane of the ER. Cleavage between NS3 and NS4A is required for the formation of an integral stable membrane bound complex, although also uncleaved NS3-4A has some ability to be targeted to cellular membranes. An a-helix that is formed during folding of the NS4A central part with the NS3 serine protease domain at the N-terminus of NS3 was shown to be capable to target cellular membranes to some extent. The obtained data suggest that this NS3 N-terminal a-helix, and especially the hydrophobic residues, is an important determinant for the membrane-association and stability of the NS3-4A complex and in consequence an important determinant for processing in the nonstructural region of the polyprotein. It was demonstrated in IVTT analyses that the NS3-4A complex has the ability to associate to microsomal membranes in a posttranslational process, suggesting that the membrane targeting of the complex occurs independently from a binding of the signal recognition particle.
In addition it was demonstrated that the membrane anchor segment of NS4A has addiditional functions aside from membrane anchoring. Mutations of completely conserved aa residues within the membrane anchor of NS4A abolished replication of a subgenomic replicon and immunofluorescence analyses revealed that at least for one mutant the formation of a functional replication complex was disturbed, suggesting that protein-protein interactions might occur on membrane anchor level. Finally FRET studies revealed for the first time that such interactions occur on membrane anchor level. Such interactions were detected between the membrane anchors of NS5A and NS5B as well as between the membrane anchor of NS5A and the full-length NS4B protein. In addition the FRET studies revealed an interaction between the full-length NS4B proteins. Taken together the study contributes to a further understanding of the formation of a functional HCV replication complex.


Kurzfassung in Deutsch

In dieser Studie wurde der Membranassoziationsmechanismus des HCV NS3-4A Komplexes und die Topologie des NS4A Proteins untersucht. Fluoreszenzmikroskopie und Membranflotationsanalysen zeigten, dass die N-terminalen 21 Aminosäuren den Membrananker des NS4A Proteins repräsentieren, und es konnte durch Glykosilierungskartierung gezeigt werden, dass der N-Terminus von NS4A die Membran des ER’s durchspannt.
Eine Spaltung zwischen NS3 und 4A wird für die Ausbildung eines stabilen membrangebundenen Komplexes benötigt, obwohl es auch ungespaltenes NS3-4A zu einem geringen Anteil vermag, an zelluläre Membranen zu binden.

Für eine alpha-Helix, die während der Faltung der Serinproteasedomäne mit dem zentralen Teil des NS4A Proteins am N-Terminus der Serinproteasedomäne gebildet wird, konnte gezeigt werden, dass sie zu einem geringen Anteil zelluläre Membranen binden kann.
Diese Daten lassen vermuten, dass die alpha-Helix und insbesondere die hydrophoben Aminosäuren der Helix, eine wichtige Determinante für die Membranassoziation und Stabilität des NS3-4A Komplexes und in Konsequenz eine wichtige Determinante für die Prozessierung in der Nichtstrukturregion des Polyproteins darstellt.

In IVTT Analysen wurde gezeigt, dass der NS3-4A Komplex die Fähigkeit besitzt, in einem posttranslationalen Prozess mit mikrosomalen Membranen zu assoziieren. Dies lässt vermuten, dass die Membranassoziation des NS3-4A Komplexes unabhängig von der Bindung des SRP (Signal Recognition Particle) stattfindet.

Zusätzlich wurde gezeigt, dass das Membranankersegment von NS4A noch zusätzliche Funktionen neben seiner Funktion als Membrananker besitzt. Mutationen von vollständig konservierten Aminosäureresten innerhalb des Membranankers von NS4A zerstörten die Replikation eines subgenomischen Replikons und Immunfluoreszenzanalysen zeigten, dass zumindest für eine Mutante die Ausbildung eines funktionellen Replikationskomplexes gestört war. Dies ließ vermuten, dass Protein-Protein Interaktionen zwischen Membranankersegmenten bestehen könnten. Durchgeführte FRET-Analysen zeigten erstmalig, dass Interaktionen auf Membranankerebene stattfinden. Interaktionen konnten zwischen dem NS5A und NS5B Membrananker sowie zwischen dem NS5A Membrananker und dem volle Länge NS4B Protein detektiert werden. Zusätzlich konnten Interaktionen zwischen volle Länge NS4B Proteinen nachgewiesen werden.
Zusammenfassend trägt diese Studie zu einem weiteren besseren Verständnis der Ausbildung eines funktionellen HCV Replikationskomplexes bei.


SWD-Schlagwörter: Hepatitis-C-Virus , Membran-Anker-Sequenz , Replikation , Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
Freie Schlagwörter (deutsch): NS3-4A Komplex , Serinprotease , Membranassoziation , Viraler Replikationskomplex , Membranankerinteraktionen
Freie Schlagwörter (englisch): NS3-4A Complex , Serinprotease , Membrane Association , Viral Replication Complex , Membrane Anchor Interactions
Institut: Institut für Biologie 1 (Zoologie)
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Driever, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.05.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 16.05.2007
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