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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-31071
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/3107/


Petersen, Jan

Fluoreszierende Proteine und gerichtete Fluoreszenzmarkierung der mitochondrialen H +-ATPsynthase aus Saccharomyces cerevisiae

Fluorescent proteins and directed fluorescence labeling of the mitochondrial H +-ATPsynthase from Saccharomyces cerevisiae

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Kurzfassung in Deutsch

H+-ATPsynthasen sind Enzyme des Energiestoffwechsels in allen lebenden Zellen. Sie sind membrangebunde Proteinkomplexe, die einen transmembranen Protonentransport mit der Synthese von ATP aus ADP und Phosphat koppeln. Bei der katalytischen Reaktion kommt es in H+-ATPsynthasen zu zyklischen Konformationsänderungen, die sich mit der konfokalen Fluoreszenzspektroskopie an einzelnen Molekülen beobachten lassen. Bislang konnte die Rotation der gamma-Untereinheit bei der ATP Hydrolyse nur mit bakteriellen H+-ATPsynthasen beobachtet werden. Entsprechende Untersuchungen an den mitochondrialen H+-ATPsynthasen wurden noch nicht durchgeführt, da sie biochemisch und molekularbiologisch schwieriger zu handhaben sind. Das Ziel dieser Arbeit war es, die biochemischen Grundlagen für fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen von Konformationsänderungen in einzelnen mitochondrialen H+-ATPsynthasen aus S. cerevisiae zu schaffen. Insbesondere sollten die Einsatzmöglichkeiten fluoreszierender Proteine (FP) untersucht werden.
Für die Messung von Bewegungen des Rotors der H+-ATPsynthase wurden Fusionsproteine von fluoreszierenden Proteinen und dem C-Terminus der gamma-Untereinheit hergestellt. Hierdurch wird die Beobachtung der Rotationsbewegungen ermöglicht, entweder durch Messung der Fluoreszenzanisotropie des FP, oder durch Messung des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) zu einem weiteren Fluorophor im Komplex. Die Verbindung zwischen dem alpha-helicalen C-Terminus der gamma-Untereinheit und dem fusionierten FP mußte möglichst stabil sein, um eine gute mechanische Kopplung zwischen beiden zu erlauben. Dafür wurde eine antiparallele, heterodimere Leucin-Zipper-Helix (zip-Helix) als Verbindungsstück zwischen der gamma-Untereinheit und dem FP verwendet. Um die Selektion geeigneter Konstrukte zu ermöglichen, wurde eine modulare Plasmidbibliothek mit unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen, verschiedenen zip-Helices und zusätzlichen funktionalisierten Übergangssequenzen aus kompatiblen DNA-Modulen hergestellt. Durch die freie Kombinierbarkeit der Module wurde eine große Zahl (> 1000) verschiedener Konstrukte in 4 Klonierungsschritten zugänglich. Von den theoretisch möglichen Konstrukten kodierten 48 Plasmide für zip-Helix-FP-Fusionsproteine (zipFP), die für die Fusion der gamma- Untereinheit geeignet erschienen. Die DNA-Sequenzen von acht ausgewählten zipFP und von zwei zip-Helices wurden mit einem Selektionsmarker (his5 aus S. pombe) erweitert, durch PCR amplifiziert und durch homologe Rekombination in die genomische Sequenz der gamma-Untereinheit der H+-ATPsynthase von S. cerevisiae integriert. Die zehn so hergestellten Hefestämme zeigten abhängig vom jeweiligen, an die gamma-Untereinheit der H+-ATPsynthase fusionierten Konstrukt unterschiedlich stark verlangsamtes Wachstum auf nichtfermentierbarem Medium. Die Hefestämme mit einem fusionierten zipFP besaßen stark fluoreszierende Mitochondrien. Um die beobachteten Effekte besser zu verstehen, wurden verschiedene zipFP gereinigt und durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) untersucht.
Die Kristallstrukturanalyse von fluoreszierenden Proteinen wurde im Rahmen dieser Arbeit eingesetzt, um detaillierte Strukturinformationen über potentielle Akzeptorfluorophore für FRET-Messungen zu erhalten. Es wurden die nah verwandten, aber spektroskopisch verschiedenen rot fluoreszierenden Proteine eqFP611 und KFP sowie das grün fluoreszierende Protein CopGFP gereinigt und kristallisiert. Die Kristallstrukturen von eqFP611 und KFP wurden in Kooperation mit P. Wilmann mit einer Auflösung von 2,0 Å und 2,1 Å bestimmt. Die Strukturanalyse dieser Proteine ergab, daß beide in der gleichen Weise wie das strukturell bekannte DsRed (Tetramer) oligomerisieren und daher für die Konstruktion von Fusionsproteinen nicht geeignet sind. Die Chromophorstrukturen von eqFP611 und KFP zeigten interessante Besonderheiten, die mit den spektroskopischen Eigenschaften dieser Proteine in Verbindung stehen.
Um die Untersuchung einzelner H+-ATPsynthasen während der ATP Synthese zu ermöglichen, wurde eine Methode zur Rekonstitution der H+-ATPsynthase in Liposomen entwickelt. Die Enzyme wurden dabei aus submitochondrialen Partikeln mit Detergens herausgelöst und in Liposomen transferiert. Mit den erhaltenen SMP-Liposomen konnte erstmals die delta µ(H+) getriebene ATP Synthese des Enzyms in Liposomen gemessen werden. Bei der Rekonstitution wurde die hohe Proteindichte der mitochondrialen Membranen stark verdünnt, wodurch konfokale Fluoreszenzmessungen an einzelnen Komplexen in langsam diffundierenden SMP-Liposomen ermöglicht wurden. Aus einem der gentechnisch erzeugten Hefestämme wurden SMP-Liposomen hergestellt und die zipFP-H+-ATPsynthase in den SMP-Liposomen mit einem organischen Akzeptorfluorophor (Alexa 568) markiert. Mit diesem doppelt markierten Enzym konnte in ersten Vorversuchen FRET gemessen werden und es wurden bei der ATP Hydrolyse auch Änderungen der FRET Effizienzen gefunden.


Kurzfassung in Englisch

H+-ATPsynthases are enzymes of the energy metabolism in all living cells. They are membrane bound protein complexes that couple a trans-membrane transport of protons with the synthesis of ATP from ADP and phosphate. In H+-ATPsynthases cyclic conformational changes occur during the catalytic reaction, which can be observed by confocal fluorescence microscopy of single molecules. To date, it is possible to observe the rotation of the gamma-subunit during ATP hydrolysis in bacterial H+-ATPsynthases only. Respective investigations with mitochondrial H+-ATPsynthases have not been conducted, as these enzymes are more difficult to handle in terms of biochemistry and molecular biology.
The goal of this work was to establish a biochemical and molecular-biological basis for the investigation of conformational changes in single H+-ATPsynthases from S. cerevisiae by means of fluorescence spectroscopy. In particular, the possible use of fluorescent proteins (FP) for this task was to be investigated.
For the measurement of rotary movements in the H+-ATPsynthase fusion proteins of fluorescent proteins and the c-terminus of the gamma-subunit were created. This made the observation of rotational movements of the gamma-subunit possible, either through detection of anisotropy of the FP fluorescence, or through measurement of fluorescence resonance energy transfer (FRET) to another fluorophore in the complex. The connection between the alpha-helical C-terminus of the gamma-subunit and the fused fluorescent protein should be as stable as possible to allow for a good mechanical coupling between the two domains. Therefore, an antiparallel, heterodimeric leucin-zipper-helix (zip-helix) was used as a joint between the gamma-subunit and the FP. To allow for the selection of appropriate constructs, a modular plasmid library was created from sequences of compatible DNA-modules coding for different FP, different zip-helices and functionalised transitional sequences. Through the free combination of the DNA-modules a large number (> 1000) of different constructs were accessible in four stages of cloning. Out of the theoretically possible constructs, 48 plasmids coded for zip-helix-FP fusion proteins (zipFP) that appeared suitable for fusion to the gamma-subunit. The DNA-sequences of eight selected zipFP-plasmids and of the two zip-helix-plasmids were extended with a selection marker (his5 from S. pombe), amplified via PCR and integrated into the genomic sequence of the H+-ATPsynthasegamma-subunit of S. cerevisiae by means of homologous recombination. Depending on the particular construct fused to the c-terminus of the gamma-subunit, the ten resulting yeast strains had specifically reduced growth speeds in nonfermentable media. The yeast strains with a zipFP fusion had intensely fluorescent mitochondria. In order to improve understanding of the observed phenomena different zipFP were purified and investigated by fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
Crystal structural analysis of fluorescent proteins was employed in the frame of this study to obtain detailed structural information about potential acceptor fluorophores for FRET measurements. The closely related, but spectroscopically distinct red fluorescent proteins eqFP611 and KFP as well as the green fluorescent protein CopGFP were purified and crystallised. In cooperation with P. Wilmann the crystal structures of eqFP611 and KFP were solved with a resolution of 2.0 Å and 2.1 Å respectively. The structural analysis showed that these proteins oligomerise in the same fashion as the tetrameric DsRed and therefore, are not suitable for the construction of fusion proteins. The chromophore structures of eqFP611 and KFP displayed interesting features that correspond with the spectral properties of these proteins.
For the investigation of single H+-ATPsynthases during catalysis, a method for reconstitution of the H+-ATPsynthase in liposomes was developed. The enzymes were solubilised with detergent from submitochondrial particles and transferred to liposomes. Using the resulting SMP-liposomes it was possible to measure delta µ(H+) driven ATP synthesis of the enzyme in liposomes. The high protein density of the mitochondrial membranes was diluted greatly during reconstitution, enabling confocal fluorescence measurements with single complexes in slowly diffusing SMP-liposomes. From one of the newly created yeast strains, SMP-liposomes were produced and the contained zipFP-H+-ATPsynthase fusion protein was labeled with an organic acceptor-fluorophore (Alexa 568). In first experiments with this doubly labeled enzyme it was possible to measure FRET as well as changes in FRET efficiencies during ATP hydrolysis.


SWD-Schlagwörter: Wasserstoff-ATP-Synthase , Grün fluoreszierendes Protein , Rot fluoreszierendes Protein , Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer , Proteindesign
Freie Schlagwörter (englisch): ATP synthase , green fluorescent protein , red fluorescent protein , protein engineering , fluorescence resonance energy transfer
Institut: Institut für Physikalische Chemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Gräber, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.12.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 05.07.2007
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