Direkt zum Inhalt | Direkt zur Navigation

Eingang zum Volltext

Lizenz

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-31136
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/3113/


Mittler, Michael

Kristallstruktur und Funktion der C-Glykosyltransferase UrdGT2 aus Streptomyces fradiae

X-ray crystal structure and function of the C-Glycosyltransferase UrdGT2 from Streptomyces fradiae

Dokument1.pdf (3.102 KB) (md5sum: fd650b9f36b1ca13d49394c006e4cf4e)

Kurzfassung in Deutsch

Die Kristallstruktur der C-Glykosyltransferase UrdGT2 aus Streptomyces fradiae wurde bei einer Auflösung von 1.9 Å aufgeklärt. Die Phasierung wurde mit dem Schweratom Gold anhand der Methode der multiple wavelength diffraction (MAD) durchgeführt.
Die asymmetrische Einheit besteht aus zwei Protomeren, wobei Protomer A als Reste 1-382 und Protomer B als Reste 1-218 und 227-384 modelliert werden konnte. Die C-Glykosyltransferase UrdGT2 besteht aus zwei Domänen, wobei beide Domänen Rossman-Motive aufweisen. Die N-terminale Domäne besteht aus einem zentralen 7-strängigen beta-Faltblatt und acht alpha-Helices. Die C-terminale Domäne besteht aus einem zentralen 6-strängigen beta-Faltblatt und neun alpha-Helices. Die N-terminale Domäne umfasst ebenfalls die Akzeptordomäne. Sie zeigt damit strukturelle Verwandtschaft zu bereits bekannten Strukturen von O-Glykosyltransferasen. Aufgrund der Abfolge der Sekundärstruktur-Elemente kann UrdGT2 in die Familie GT-B der Glykosyltransferasen eingeordnet werden. Die Struktur von UrdGT2 ist die erste Struktur einer C-Glykosyltransferase, die aufgeklärt wurde. Die wesentlichen Unterschiede zu O-Glykosyltransferasen betreffen die Länge der loops zwischen den Sekundärstrukturelementen in beiden Domänen, sowie die Akzeptordomäne. So zeigt UrdGT2 im Vergleich zu den homologen Enzymen GtfA und GtfD außergewöhnlich lange loops, die vermutlich der Substrat-Anpassung (induced-fit) dienen. Die Akzeptordomäne unterscheidet sich deutlich von der anderer Glykosyltransferasen, was durch das stark divergierende Spektrum der Akzeptor-Substrate erklärt werden kann.
UrdGT2 zeigt besondere Eigenschaften durch die Katalyse zweier chemisch unterschiedlicher Reaktionen, sowohl die C- als auch die O-glykosidische Zuckerübertragung werden katalysiert (duale Chemoselektivität). Der Mechanismus der C-Glykosylierung ist bisher weitestgehend unaufgeklärt. Weiterhin zeigt UrdGT2 eine stark relaxierte Substrat-Spezifität für sowohl das Donor- als auch das Akzeptor-Substrat. Die Komplex-Struktur mit Substraten bzw. Substrat-Analoga sollte die Selektivität der Zuckererkennung und die Flexibilität für das Akzeptor-Substrat hinsichtlich seiner nukleophilen Eigenschaften aufklären. Durch sehr umfangreiche Kristallisations- und Tränkexperimente konnten zwar streufähige Kristalle erhalten werden, jedoch lag UrdGT2 in keinem der Kristalle als Liganden-Komplex vor. Dieses Ergebnis entspricht denen aus vergleichbaren Experimenten mit homologen Glykosyltransferasen.
Der strukturelle Vergleich mit O-Glykosyltransferasen zeigt, daß die Donor-Substrat-Bindung und die Positionierung des Nukleophils in Glykosyltransferasen der Familie GT-B hochkonserviert sind. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde ein Modell für die Substrat-Bindung in UrdGT2 vorgeschlagen. Das Modell der Bindung des Donor-Substrats dTDP-D-Olivose, sowie den Akzeptor-Substraten UWM6 und Alizarin liefert eine mögliche Erklärung für den Reaktionsmechanismus, insbesondere für die Aktivierung des nukleophilen C-Atoms, sowie für die duale Chemoselektivität. Danach erlaubt eine nach oben geöffnete Kavität und die Bindung des Akzeptor-Substrats von nur einer Seite die sterische Variation des Akzeptor-Substrats in der Akzeptor-Bindungs-Domäne.
Die Aufklärung der Kristallstruktur der C-Glykosyltransferase UrdGT2 bildet die Grundlage zur Veränderung des Substratspektrums durch Mutation der Akzeptor-Domäne. Diese Veränderung erweitert die Einsatzmöglichkeiten von UrdGT2 in der kombinatorischen Biosynthese zur Darstellung von neuen potentiell antibiotisch bzw. anti-tumoralen Substanzen, um dem Problem der zunehmend auftretenden Resistenz von Mikroorganismen gegen klinisch verwendete Antibiotika entgegenzutreten. Aber auch die C-Glykosylierung von Substanzen durch enzymatische Katalyse eröffnet neue Perspektiven zur Veränderung der pharmakologischen und pharmakokinetischen Eigenschaften von Arzneistoffen, um ihre Wirksamkeit zu erhöhen.


Kurzfassung in Englisch

The X-ray crystal structure of the C-Glycosyltransferase UrdGT2 from Streptomyces fradiae was established at a resolution of 1.9 Å. Phasing was accomplished with a gold derivative using multiple anomalous dispersion.
The asymmetric unit consists of 2 protomers. Residues 1 to 382 in protomer A and residues 1-218 and 227-384 in protomer B were modelled. The C-Glycosyltransferase UrdGT2 consists of 2 domains with both domains showing Rossman-fold-like secondary structure motifs. The N-terminal domain is composed of a central 7-stranded beta-sheet and 8 alpha-helices and comprises the acceptor domain. The C-terminal domain consists of a central 6-stranded beta-sheet and 9 alpha-helices. The overall structure shows a high degree of similarity to existing O-Glycosyltransferase structures. Due to the sequence of secondary structure elements UrdGT2 can be classified as a member of the GT-B familiy of glycosyltransferases. The X-ray crystal structure of UrdGT2 is the first structure of a C-Glycosyltransferase that has been established. The main differences compared to O-Glycosyltransferases are the divergent length of loops connecting secondary structure elements and the acceptor domain. In contrast to the homologous enzymes GtfD and GtfA, UrdGT2 shows unusually long loops that presumably serve substrate accomodation and induced-fit. The acceptor domain differs significantly from that of other glycosyltransferases wich can be accounted for by the large divergence of acceptor substrates among these enzymes.
UrdGT2 shows very special features by the catalysis of two chemically divergent reactions since C- as well as O-glycosidic sugar transfer can be catalysed (dual chemoselectivity).The mechanism of C-Glycosylation is widely unknown. Furthermore UrdGT2 shows a relaxed substrate specificity for the donor- as well the acceptor substrate.
The ligand-complex-structure with subtrates or substrate-analoges was to elucidate the selectivity of sugar recognition and the flexibility for the acceptor substrate. Even though very extensive soak- and co-crystallisation-experiments were performed and dispersive crystals were obtained none of them showed additional density for the ligand. This result corresponds to earlier results from comparable experiments with homologous glycosyltransferases.
Structural comparison with O-Glycosyltransferases shows the highly conserved donor-substrate binding and the conserved positioning of nucleophiles in glycosyltransferases of the GT-B family. Due to this finding a model of substrate-binding in UrdGT2 was proposed. The model describes the binding of the natural donor-substrate dTDP-D-Olivose and the acceptor-substrates UWM6 and Alizarin and offers a possible explanation for the reaction mechanism and especially the activation of the nucleophilic carbon atom as well as for the dual chemoselectivity. According to this model a cavity opened to the outside and a single binding site allows sterical variations in the acceptor substrate within the acceptor-binding domain.
The elucidation of the X-ray crystal structure of the C-Glycosyltransferase UrdGT2 establishes a basis for the modification of substrate specificity by mutation of the acceptor domain. These modifications can broaden the versatility of UrdGT2 in combinatorial biosynthesis for the synthesis of new potentially anti-biotic and anti-tumoral substances to tackle the emerging problem of resistance of microorganisms against clinically applied antibiotics. But C-Glycosylation of chemical compounds by enzymatic catalysis also offers new perspectives for the modification of the pharmacological and pharmcokinetic properties of drugs to increase their potencies.


SWD-Schlagwörter: Dissertation
Freie Schlagwörter (deutsch): C-Glykosyltransferase, Kristallstruktur, Antibiotika, Urdamycin A
Freie Schlagwörter (englisch): crystal structure, C-Glycosyltransferase, Antibiotics, Urdamycin A
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schulz, Georg E. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.06.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 07.08.2007
Indexliste