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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-31283
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/3128/

Schmid, Björn

Albuminbindende, enzymatisch spaltbare Camptothecin-Derivate – antitumoral wirksame Prodrugs für eine effizientere Krebstherapie

Albumin-binding, enzymatically cleavable camptothecin derivatives - antitumoral prodrugs for a more effective cancer therapy

Kurzfassung in Deutsch

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Ansatz eines neuartigen, makromolekularen Prodrugkonzepts auf selektiv-enzymatisch im Tumor spaltbare Prodrugs mit dem antitumoral aktiven Naturstoff Camptothecin (CPT) erweitert werden. Das passive Drug-Targeting-Prinzip der albuminbindenden Prodrugs beruht auf der Verabreichung eines Maleinimid-funktionalisierten, niedermolekularen Prodrugs, das in situ kovalent an endogenes Serumalbumin bindet und als Albuminkonjugat über den sogenannten EPR-Effekt eine passive Anreicherung im Tumorgewebe erfährt. Für eine Spaltung des Prodrugs und die Freisetzung des Wirkstoffes CPT im Tumorgewebe kann man sich die Überexpression verschiedener tumorassoziierter Proteasen von Nutzen machen.
In einem ersten Ansatz wurde ein selektiv Cathepsin-B-spaltbares, albuminbindendes CPT-Prodrug, das sich durch gute Wasserlöslichkeit (>7 mg/mL, CPT: 2.5 µg/mL) und eine schnelle, selektive und quantitative Bindung an Serumalbumin auszeichnet, synthetisiert. Darüber hinaus zeigte das Prodrug eine gute Plasmastabilität (t1/2 = 32 h). Zwischen Maleinimid und Wirkstoff wurde als Proteasesubstrat der mehrfach literaturbeschriebene, selektiv Cathepsin-B-spaltbare Tetrapeptidlinker Ala-Leu-Ala-Leu eingebaut. Zusätzlich wurden zwei basische Arginin-Reste eingefügt, die für die gute Wasserlöslichkeit verantwortlich sind. Der Einbau eines Alanin-Spacers zwischen CPT und dem Linker erweist sich als vorteilhaft für eine Freisetzung von CPT. Das resultierende Prodrug EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-CPT zeigte in vitro eine selektive Spaltung, sowohl durch das häufig in Tumoren überexprimierte Cathepsin B als auch in HT-29-Kolontumorgewebehomogenat. Als Spaltprodukte konnten H-Leu-Ala-Leu-Ala-CPT, H-Ala-Leu-Ala-CPT, H-Leu-Ala-CPT, H-Ala-CPT und CPT nachgewiesen werden. In vivo bewies das Prodrug an einem humanen HT-29-Kolontumor-Xenograft-Modell der Nacktmaus eine bei weitem bessere Antitumoraktivität als der freie Wirkstoff CPT [T/C max.: 17 % für das Prodrug (3 x 12.5 mg/kg CPT-Äquivalente) und 40 % für CPT (3 x 12.5 mg/kg)].
Im zweiten Ansatz sollten durch Screenen einer fluorogenen Positional-Scanning-Tetrapeptidbibliothek (PS-Bibliothek) selektiv in Kolontumorgeweben spaltbare Peptidsequenzen identifiziert werden, die nachfolgend als Linker-Baustein in albuminbindende CPT-Prodrugs der allgemeinen Formel EMC-Arg-P4-P3-P2-P1-Ala-CPT eingebaut werden sollten. Dazu wurden verschiedene Kolontumorgewebehomogenate, Brusttumorhomogenate und Gewebehomogenate gesunder muriner Leber, Niere und Milz mit der PS-Bibliothek über 1 h inkubiert. Die erhaltenen Spaltungsprofile zeigten bei pH 7.4 eine Präferenz für Met, Leu und Lys in der Position P1 und Tyr, Phe und Met in der Position P2. Die Spaltungsprofile der Positionen P3 und P4 waren weniger charakteristisch, sodass keine eindeutigen Zuordnungen getroffen werden konnten. Ebenso zeigten die jeweiligen Spaltungsprofile der Inkubation mit verschiedenen Tumorgewebehomogenaten und Gewebehomogenaten gesunder, muriner Organe keine signifikanten Unterschiede und somit konnten keine Tumor-selektiv spaltbaren Peptidsequenzen nachgewiesen werden. Dessen ungeachtet wurden die zwei Linker-Bausteine H Arg-Ala-Phe-Met-OH und H-Arg-Phe-Tyr-Met-OH (P4-P3-P2-P1) in CPT-Prodrugs eingebaut. Beide Prodrugs zeigten eine schnelle, selektive und quantitative Bindung an Serumalbumin, eine gute Wasserlöslichkeit (>7 mg/mL) und eine gute Plasmastabilität (t1/2 = 25 h und 26 h). HPLC-Spaltungsstudien über 24 h mit HT-29-Kolontumorgewebehomogenat und Gewebehomogenaten gesunder muriner Organe zeigten eine gute Spaltung der Prodrugs und eine Freisetzung von CPT. Obwohl die eingebaute Peptidsequenz nicht selektiv in Kolontumoren spaltbar ist, wurde das Prodrug EMC-Arg-Arg-Ala-Phe-Met-Ala-CPT in einer In-vivo-Studie an einem humanen HT-29-Kolontumor-Xenograft-Modell der Nacktmaus getestet und zeigte ähnlich gute Antitumoraktivität wie das Cathepsin-B-spaltbare Prodrug [T/C max.: 17 % für das Prodrug (2 x 12.5 mg/kg CPT-Äquivalente) und 40 % für CPT (3 x 12.5 mg/kg)].

Kurzfassung in Englisch

In the context of this dissertation, a novel, macromolecular prodrug concept for enzymatically cleavable prodrugs of the cytostatic drug camptothecin (CPT) was investigated. The passive drug targeting concept of albumin-binding prodrugs is based on the application of a maleimide-modified, low-molecular weight prodrug that binds in situ covalently to endogenous serum albumin and afterwards is passively accumulated as a drug-albumin conjugate via the EPR-effect (enhanced permeability and retention effect) in the tumor tissue. For cleavage of the prodrug and release of the active agent CPT, the over-expression of several tumor associated proteases can be utilized.
In a first approach a water-soluble camptothecin prodrug that incorporates the peptide linker Ala-Leu-Ala-Leu that serves as a substrate for the tumor-associated protease, cathepsin B, which is over-expressed in several solid tumors was developed. Consequently, an albumin-binding prodrugs was synthesized, EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-CPT (EMC = 6-maleimidocaproic acid)]. The incorporation of two arginine residues rendered the prodrug water-soluble (> 7 mg/mL), while the use of alanine as amino acid spacer proved to be beneficial for the release of the active agent. The prodrugs exhibited excellent water-solubility (>7 mg/mL, CPT: 2.5 µg/mL) and bound rapidly and selectively to the cysteine-34 position of endogenous albumin. Further in vitro studies showed that the albumin-bound form of the prodrug was cleaved specifically by cathepsin B as well as in human tumor homogenates. H-Leu-Ala-Leu-Ala-CPT, H-Ala-Leu-Ala-CPT, H-Leu-Ala-CPT, H-Ala-CPT and CPT were identified as cleavage products. In vivo, the CPT-prodrug was superior to free camptothecin in an HT-29 human colon xenograft model [T/C max.: 17 % for the prodrug (3 x 12.5 mg/kg CPT-equivalents) and 40 % for CPT (3 x 12.5 mg/kg)].
In a second approach, as a new strategy, homogenates of a spectrum of human colon tumor xenografts were incubated with a fluorogenic positional scanning tetrapeptide library (PS-library) in order to identify peptide sequences that are preferentially cleaved by colon tumors. The screening experiments at pH 7.4 revealed that Met, Leu, and Lys were preferred amino acids in the position P1 and Tyr, Phe, Met in P2, whereas in P3 and P4 the cleavage profiles were less characteristic. However, similar results were obtained when testing breast tumor material and homogenates from healthy murine organs. Based on these results, albumin-binding camptothecin prodrugs of the general formula EMC-Arg-P4-P3-P2-P1-Ala-CPT (EMC = 6-maleimidocaproic acid) that incorporated two peptide linkers: H-Arg-Ala-Phe-Met-OH and H-Arg-Phe-Tyr-Met-OH (P4-P3-P2-P1) were developed. Incubation studies with homogenates of HT-29 colon tumor tissue and murine spleen, liver, and kidneys demonstrated cleavage of the peptide linker with CPT-peptide derivatives and CPT being the major cleavage products. Although the peptide sequence is not selectively cleaved in colon tumors, an in vivo study in a HT-29 xenograft model showed that the prodrug EMC-Arg-Arg-Ala-Phe-Met-Ala-CPT demonstrated enhanced antitumor efficacy when compared to CPT [(T/C max.: 17 % for the prodrug (2 x 12.5 mg/kg CPT equivalents) and 40 % for CPT (3 x 12.5 mg/kg)].