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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-31304
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/3130/


Häfele, Stefanie Yvonne

DNA-Aufnahme und intrazelluläres Trafficking an Primärzellen mittels lipid- und polymerbasierten, nicht-viralen Transfersystemen

DNA-uptake and intracellular trafficking on primary cells via lipid- and polymerbased, non-viral transfer systems

Dokument1.pdf (9.719 KB) (md5sum: 477adf4849d6792774a992ead97bd16d)

Kurzfassung in Deutsch

Immer mehr Krankheiten sind bekannt, die auf Fehlern im genetischen Code be¬gründet sind. Ziel der soma¬tischen Gentherapie ist es, diese Gendefekte spezifisch in den betroffenen Zellen zu beheben, wobei ein Eingriff in die Keimbahn nicht erlaubt ist.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Aufklärung von Internalisierung und intrazellulärem Schicksal von nicht-viralen Gentransfersystemen am Beispiel von einem etablierten lipidbasierten Transfersystem (DC-30/DNA) sowie DNA-Komplexen aus 11 verschiedenen monodispersen Poly¬amido¬aminen (PAA), die am Max-Planck-Institut in Golm synthetisiert wurden. Die Untersuchungen wurden hauptsächlich an humanen primären Endothel- und glatten Muskelzellen durchgeführt. Diese sind kaum transfizierbar, die Ursache dafür ist jedoch nicht bekannt.

Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte zuerst eine Charakterisierung der verwendeten Polymere und der daraus hergestellten Polyplexe (Polymer/DNA-Aggregate). Komplexbildung und Stabilität wurde mittels Gel-Elektrophorese und AFM-Auf¬nahmen untersucht. Zytotoxizität wurde über einen Vitalitätstest bestimmt.

Mittels Durchflusszytometrie und spektralem Bio-Imaging wurden die bis heute bekannten Endo¬zytosemechanismen Clathrin-ver¬mittelte Endozytose, Caveolae-ver¬mittelte Endozytose, Makro¬pinozytose, Phago¬zytose und Non-Clathrin-non-Caveolae-vermittelte Endozytose unter¬sucht. Die lipidbasierten Transfersysteme wurden in ca. 20 % der HAEC (humane Aorta Endothel¬zellen) und 80 % der HASMC (humane glatte Muskelzellen der Aorta) auf¬ge¬nommen, je nach Polymer wurde eine Polyplexaufnahme in bis zu 77 % der Zellen erzielt. Mittels Endo¬zytose¬inhibitoren und -markern für die verschiedenen Auf¬nahme¬wege konnte gezeigt werden, dass Polyplexe von beiden Zellarten überwiegend über Caveolae-vermittelte Endozytose internalisiert werden, während DC-30/DNA in HASMC ausschließlich über Clathrin-vermittelte Endozytose und in HAEC zusätzlich über Caveolae-vermittelte Endozytose aufgenommen werden. Die Transfektionseffizienzen aller Gentransfersysteme waren jedoch so gering, dass weitere Untersuchungen nur noch mit DC-30 Lipoplexen durchgeführt wurden, da diese zumindest in Zelllinien zu sehr guten Transfektionseffizienzen führen (bis zu 50 %).

Mittels immunchemischer Methode (Antikörperfärbungen der endosomalen Komparti¬mente) konnten die internalisierten fluoreszenz-markierten DC-30 Lipoplexe innerhalb der Zelle noch genauer verfolgt werden. Es sollte untersucht werden, welche zellulären Barrieren die Trans¬fektionseffizienz beeinflussen. Es zeigte sich, dass DC-30 Lipoplexe sowohl in HAEC als auch in HASMC aus den Endosomen ins Zytosol frei¬gesetzt wurden. Es konnten keine Lipo¬plexe in lysosomalen Kompartimenten lokalisiert werden. Dies bedeutet, dass für diesen kationischen Lipoplex eine ausreichende Freisetzung aus den späten Endosomen ins Zytosol möglich ist. Bestätigt wurde dieses Ergebnis durch Experimente mit Chloroquin. Diese Substanz kann die Freisetzung des endozytierten Materials aus den Endosomen erleichtern, hat jedoch in den vorliegenden Versuchen die Transfektionseffizienz nicht gesteigert. Mittels Elektroporationsexperimenten (Einbringen von DNA in die Zellen durch kurzfristige Membranstörung) in HAEC, die zeigen sollten, ob die DNA im Zytosol abgebaut wird, lag die GFP-Expression bei über 40 %, in HASMC bei bis zu 50 %.

Die vorliegenden Untersuchungen geben Hinweis darauf, dass eine Hauptursache für geringe Transfektionseffizienzen in den untersuchten Primärzellen vermutlich eine unzu¬reichende Dissoziation der DNA-Komplexe in der Zelle darstellt. Aufbauend auf diesen Erkennt¬nissen können weiterführende Untersuchungen gezielt die Dissoziation der Kom¬plexe untersuchen und optimieren.


Kurzfassung in Englisch

In order to improve the delivery efficiency of genetic material into human primary cells both in vitro and in vivo, the development of effective non viral vectors for optimized gene transfer into target cells has become an important objective.
But still transfection with non-viral gene delivery vectors, either lipid/DNA- or polymer/DNA-aggregates unfortunately in most cases results in low transgene expression in vivo. This might be due to poor cytoplasmic transport and intra-nuclear DNA delivery.
Therefore knowledge about the uptake mechanism and subsequent intracellular processing of non-viral gene delivery systems is important for the development of efficient gene delivery systems.
In this study we focused on non-viral gene delivery into human endothelial (HAEC) and human vascular smooth muscle cells (HASMC) using cationic lipids or polymer-based aggregates (polyamidoamines - PAAs). Due to their controllable size, length and monomer composition, their peptidomimetic structures, monodispersity and low cytotoxicity especially the PAA´s may be promising new tools for non viral gene delivery.
The effects of several inhibitors of particular cellular uptake routes on lipoplex/polyplex uptake were investigated by means of flow cytometry. Moreover, cellular localization of fluorescently labeled lipo-/polyplexes was assessed by Spectral Bio-Imaging and Confocal Microscopy.
It was shown that the lipoplex uptake mechanism in both, HAEC and HASMC was clathrin-mediated. In addition, HAEC internalized lipoplexes via caveolae-mediated endocytosis as well. In contrast PAA-based polyplexes exclusively showed internalization via caveolae-mediated pathway in both primary cells.
As it is known that clathrin-mediated internalized particles mainly end up in lysosomes to be digested and degraded, caveolae dependent uptake is supposed to target the golgi apparatus and the endosomes. Moreover material seems to be released directly into the cytosol to be transported to the nucleus.
Within this work accomplished assays led to the conclusion that an insufficient dissociation of complex can be considered as the major barrier for low transfection efficiency.
Thus, well characaterized internalization, processing of lipo-/polyplexes and controllable dissociation of the genetic material from the delivery system offer new possibilities to target a discrete pathway and to increase transfection rates.


SWD-Schlagwörter: Caveolae , Clathrin , targeted drug delivery , Endocytose , Lipoplexe , Polyplexe
Freie Schlagwörter (deutsch): Primärzellen , DC-30 , konfokale Mikroskopie , Spektrales Bio-Imaging , Polyamidoamine
Freie Schlagwörter (englisch): spectral bio-imaging , confocal microscopy , DC-30 , primary cells , polyamidoamines
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Peschka-Süss, Regine (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.06.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 16.07.2007
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