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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-31462
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/3146/


Ebert, Matthias

Analyse der gamma Protocadherine durch Funktionsverlust und Überexpression in der Maus

Functional analysis of gamma protocadherin in the mouse

Dokument1.pdf (18.962 KB) (md5sum: 92d25ba5626ad0a0bdd0f1d745555c3b)

Kurzfassung in Deutsch

In dieser Doktorarbeit wurde die Funktion der gamma Protocadherine (Pcdh) anhand verschiedener transgener Mausmodelle zur Überexpression eines speziellen Gens bzw. zum Funktionsverlust des gesamten Klusters untersucht.
Protocadherine sind Cadherin-ähnliche, Kalzium-abhängige Zelladhäsionsmoleküle. Sie werden überwiegend in neuronalem und mesenchymalem Gewebe beginnend ab dem frühembryonalen Stadium E8.5 exprimiert. Im adulten Stadium sind sie an den Synapsen differenzierter Neurone konzentriert, was eine Mitwirkung an der Errichtung der synaptischen Spezifität und der Aufrechterhaltung der synaptischen Signalübertragung zugeschrieben wird.
Das gamma Protocadherin-Kluster der Maus enthält 22 verschiedene Gene, welche für Transmembranproteine vom Typ I kodieren. Sie besitzen jeweils eine variable extrazelluläre und eine größtenteils identische zytoplasmatische Domäne, die durch drei kleine Exone am 3 Ende des Klusters kodiert werden. Wir haben Mäuse mit einer Insertion einer gene-trap Reporter/Selektor Kassette zwischen dem zweiten und dem dritten konstanten Exon generiert und analysiert, welche in der Verkürzung der zytoplasmatischen Domäne um 75 Aminosäuren resultiert. Homozygote trap-Mäuse exprimieren nur geringe Mengen der verkürzten Pcdh Transkripte bzw. Proteine und versterben kurz nach der Geburt mit schwerwiegenden neurologischen Symptomen. Histologisch zeigen sie eine deutliche Verkleinerung des Rückenmarksdurchmessers ähnlich den zuvor veröffentlichten gamma Kluster knock-out Mäusen. Wir beobachten zusätzlich eine Tendenz zur Entwicklung von Nabelhernien in Verbindung mit einer teilweisen Verlagerung von Darmschlingen und Leber in den Bereich vor das Sternum sowie geringe Skelettdeformationen an den Rippen und dem Schaufelknorpel. Diese Veränderungen deuten auf Probleme bei der Fusion der ventralen Mittellinie und Defizite bei der Signalübertragung zwischen epithelialen und mesenchymalen Geweben.
Desweiteren wurden verschiedene Protocadherin gamma C5 exprimierende Mauslinien, eine knock-in Linie in den ROSA26 Genlokus und eine herkömmliche Zufalls-Integration unter Kontrolle des Hühnchen beta-Aktin Promotors generiert und analysiert. Dieses spezifische Gen wurde aufgrund seines charakteristisch späten endogenen Expressionsstarts gewählt und zur Identifizierung am zytoplasmatischen 3 Ende mit dem gelb-fluoreszierenden Protein fusioniert. Zur gezielten, Cre-Rekombinase vermittelten Expression von Pcdh gamma C5 wurde es in beiden Fällen hinter eine von loxP Erkennungssequenzen flankiertebeta-Galaktosidase-Reporterkassette gesetzt. Die knock-in Mäuse zeigten eine starke Expression des primären Reportergens in allen Geweben, wohingegen die konventionellen transgenen Linien variierende Expressionsstärken und Gewebe aufwiesen.
Die Überexpression der Pcdh gamma C5 Konstrukte verursachte keine erkennbaren anatomischen oder histologischen Veränderungen und war desweiteren nicht in der Lage den lethalen Phenotyp der homozygoten gene-trap Mäuse zu modifizieren oder zu verhindern. Die weitere Analyse der knock-in Linie zeigte allerdings eine interessante gewebespezifische Regulation der Protocadherin Proteinexpression vom rekombinierten Konstrukt. Die Expression des Fusionsproteins erfolgte erkennbar nur in Geweben mit endogener Pcdh Expression, was auf das mögliche Vorhandensein eines benötigten Kofaktors für die erfolgreiche Protocadherinexpression deuten könnte. Abseits dieser neuen funktionellen Aspekte konnten wir mit dieser Mauslinie zum ersten Mal die erfolgreiche Expression eines transmembranären Proteins als knock-in in den ROSA 26 Genlokus zeigen.


Kurzfassung in Englisch

In this PhD thesis we have analyzed the function of gamma-protocadherins with the help of different transgenic mouse models, a loss of function and two specific gain of function mouse lines.
Gamma-protocadherins (Pcdh) are members of the cadherin superfamily of calcium-dependent adhesion molecules. They are expressed predominantly in neuronal and mesenchymal tissues starting around embryonal day E8.5 in the mouse. Pcdh gamma are enriched at synapses of differentiated neurons suggesting functions in synaptic adhesion and signaling which may contribute to synaptic specificity.
The Pcdh gamma cluster contains 22 genes which share a family-specific cytoplasmic region encoded by three exons located at the end of the cluster. We analyzed mice with an insertion of a gene-trap reporter/selector cassette between the second and third constant region exon. Homozygous gene-trap mice largely lacked Pcdh transcripts and proteins and died shortly after birth with severe neurological symptoms. Histological analysis showed reduction of the spinal cord size, similar to previous reports from Pcdh gammacluster knock-out mice. We noted additional phenotypes including umbilical hernia of the gut and mild skeletal defects at the ribs and the xiphoid process of the sternum, whereas heterozygous gene-trap animals appeared normal. These alterations indicate deficiencies in the midline closure of the ventral body wall of homozygous Pcdh gamma gene-trap mice which may be caused by alterations of mesenchymal-epithelial signaling.
Next we have generated mouse lines overexpressing a specific Pcdh, Pcdh gamma C5, a family member with a characteristic late postnatal onset of endogenous expression. Two approaches were chosen for conditional overexpression of fluorescently tagged Pcdh gamma C5. First, homologous recombination to the ROSA26 locus (“knock-in”) which makes use of the strong and ubiquitous ROSA26 promoter. Second, random insertion of the construct which is driven by a chicken beta-actin promoter (“conventional transgenic”). In both cases expression was made possible after Cre-mediated removal of a floxed beta-galactosidase gene. The knock-in ROSA26 mice showed a robust and ubiquitous expression of this primary beta-galactosidase reporter, whereas reporter expression in the conventional transgenic lines was restricted to specific tissues. Transgenic mouse lines with high levels of expression in the nervous system and in mesenchymal tissue were selected for further analysis.
Pcdh gamma C5 overexpression did not cause any obvious anatomical or histological phenotype, however, was not able to rescue the lethal phenotype of homozygous gene-trap mice. Further analysis of the ROSA26 knock-in line revealed, that the expression of Pcdh gamma C5 is regulated in a tissue-specific manner, reflecting the pattern of endogenous Pcdh gamma expression and arguing that co-factors may be needed for robust Pcdh expression. Next to these novel functional aspects we showed with this mouse line for the first time the successful expression of a transmembrane protein via a knock-in approach to the ROSA26 gene locus.


SWD-Schlagwörter: Protocadherin , gene-trap
Freie Schlagwörter (deutsch): Protocadherin , gene-trap , knock-in , Transgene , ROSA26
Freie Schlagwörter (englisch): protocadherin , gene-trap , knock-in , transgene , ROSA26
Institut: Max-Planck-Institut für Immunbiologie
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Kemler, Rolf (Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.01.2006
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 13.08.2007
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