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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-31533
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/3153/


Zocher, Georg Ernst

Strukturaufklärung der biotechnologisch interessanten Enzyme O-Acetylserin-Sulfhydrylase und p-Aminobenzoat N-Oxygenase

Structure determination of enzymes with biotechnical impact - an O-acetylserin sulfhydrylase and a p-Aminobezoate N-oxygenase

Dokument1.pdf (10.406 KB) (Dissertation im pdf-Format) (md5sum: 10b39bffbf1372d7c6e2c1150cf2d4ab)

Kurzfassung in Deutsch

Die Arbeit befasste sich mit der Strukturaufklärung zweier Enzyme, die bereits in der groß­indus­triellen, biotechnolo­gischen Produktion eine Rolle spielen (Cystein-Produktion mit CysM) bzw. dessen Einsatz für derartige Verfahren geprüft wird (N-Oxidationen mit AurF). Dabei konnten folgende Ergebnisse erhalten werden:

Zunächst wurde durch Protein-engineering an der O-Acetylserin-Sulf­hydry­lase CysM aus Escherichia coli eine neue Kristallform hergestellt. Diese konnte durch Einführen der Ober­flächen­mutante K268A erhalten werden. Diese Kristallform gehört zur Raumgruppe P6522 und enthält ein einzelnes Protomer in der asymmetrischen Untereinheit. Damit bietet es sich für zukünftige Struk­tur­unter­suchungen an. Mit der erzielten Auflösung von 1.33 Å ist diese Struktur die zur Zeit best-aufgelöste Struktur aller Sulfhydrylasen in der Proteindatenbank. In dieser Struktur konnte eine Konformation ge­funden werden, die zweifelsfrei einen Zwi­schen­zu­stand des Proteins aus den be­kannten Strukturen der offenen und geschlos­senen Form gleich­kommt. Da im aktiven Zentrum des Proteins zusätzlich ein Substrat-ähnliches Citratmo­lekül gefunden werden konnte, wurde auf der Basis dieser Bindung ein Modell für den Teilschritt der enzym­katalysierten Reaktion vom Amino­acrylat zum Produkt aufgestellt. Zusätzlich konnte ein Modell für den nukleophilen Angriff des im Aktivitätstest verwendeten 5-Mercapto-2-nitrobenzoat aufgestellt werden. Der in einer Diplom­arbeit etablierte Enzym­assay (Wiesand, 2007) bestätigte dieses Modell durch Messung der Aktivität gezielt hergestellter Mutanten. Dabei konnte die besondere Bedeutung der bereits in vorhergehen­den Arbeiten (Claus et al., 2005) beschriebenen Aminosäure Arg210 bestätigt werden, die für die relaxier­te Substrat­spezifität verantwortlich ge­macht wurde. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit sind die Grundlagen für eine gezielte Anpassung des Enzyms an weitere unnatürliche Substrate geschaffen worden. Diese Anpassung sowie die Optimierung der aktiven Bindestelle an die einsetzbaren Substrate sollten Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.

Weiterhin wurde eine neuartige N-Oxygenase aus Streptomyces thioluteus untersucht. Dieses zu den Monooxygenasen zählende Enzym, das keine Sequenz­homo­logie zu Proteinen bekannter Funktion zeigt, katalysiert die hoch regioselektive Oxidation von p‑Aminobenzoat zu p‑Nitro­benzoat. Jedoch werden auch Derivate der p‑Amino­benzoesäure als Substrate ak­zeptiert und machen das Enzym für die biotechno­logische Produktion dieser Stoffklasse interessant. Das Protein konnte kristallisiert und die Struktur durch MAD-Phasierung mit einem cisPlatin-Derivat bis zu einer Auflösung von 2.1 Å gelöst werden. Die dimere N-Oxygenase besteht aus einer einzelnen Domäne mit elf α-Helices. Auf der Basis von Strukturvergleichen konnte die Faltung der N‑Oxy­ge­nase den anderer sauerstoff­akti­vieren­der, zweikerniger Eisen-Enzyme und letzlich der Ribo­nukleotid-Reduktase-Familie zuge­ord­net wer­den. Die charakteristi­sche Eigenschaft dieser Enzyme ist ein zentrales vier-Helix-Bündel, das den als Cofaktor fungieren­den zweikernigen Metallcluster beinhaltet. Die Identität des Metalls wurde anhand eines speziellen MAD-Exper­iments bestimmt und durch ESR bestätigt. Dabei konnte zweifelsfrei ein Mangan-zu-Eisen-Verhältnis von 8:1 nach­gewiesen werden. Die hohe Präferenz der N-Oxygenase zu Mangan steht damit im Wider­spruch zur postu­lierten Eisen-Abhängigkeit des Enzyms. Aufgrund dieser Unter­suchungen wurde AurF als Mangan-abhängiges Enzym postuliert. Als charakteristisches Merkmal dieser neuen Enzymklasse wurde ein koordinieriendes Histidin identifiziert, das in den zu AurF homologen Proteinen hoch konser­viert ist und in keinem der struktur­verwandten Proteine gefunden wurde. Ein Modell der Substratbindung des Enzyms konnte erstellt und durch Aktivitätsstudien ausge­wählter Mutanten bestätigt werden. Dabei zeigten die mutierten Aminosäuren einen großen Einfluss auf die Geschwin­digkeit der Reaktion und könnten als Ansatzpunkt der gezielten Anpas­sung des Enzyms für den biotechno­logischen Einsatz dienen. Zudem bieten sich auf der Basis dieser Strukturdaten weitere Mutationss­tudien in Kombination mit Aktivität­messungen für eine gezielte Optimierung von AurF an nicht-natürliche Substrate an. Desweiteren bleibt die Mangan-Ab­hängigkeit der N‑Oxygenase zu bestätigen. Ein wichtiger Ansatzpunkt ist hierbei die Mutation des für AurF charakteristischen His223, das im Zuge weiterer Untersuchungen zu hydrophoben Resten Ile, Val und Ala mutiert werden könnte. Diese Reste finden sich an entsprechender Position bei den struktur­verwandten Eisen-abhängigen Enzymen.


Kurzfassung in Englisch

The structure of the dimeric O-acetylserine sulfhydrylase (OASS) isozyme B from Escherichia coli (CysM) in complex with the substrate-analogue citrate has been determined at 1.33 Å resolution. Citrate binds with one of its carboxylates at the carboxylate position of O-acetylserine while the remainder adopts two conformations. The activity of the enzyme and of several active center mutants was determined with an assay based on O-acetylserine and thio-nitrobenzoate that is well accepted by CysM. Based on the reported structure, the reaction geometry for the unnatural substrate thio-nitrobenzoate was modeled. The model is supported by the observed residual activity of the active center mutants. The results facilitate future protein engineering attempts to broaden the substrate spectrum of the enzyme. A comparison with previous analyses at medium resolution indicated large induced-fit movements during catalysis. Moreover, it showed an asymmetry between the subunits of two dimers in one crystal form indicating that the enzyme may work with half-site reactivity, possibly applying a counterweight system.

Nitro groups are found in a number of bioactive compounds. Most of them arise by a stepwise mono-oxygenation of amino groups. One of the involved enzymes is AurF participating in the biosynthesis of aureothin. Its structure was established at 2.1 Å resolution showing a homodimer with a binuclear manganese cluster. The enzyme preparation, which yielded the analyzed crystals, showed activity using in vitro and in vivo assays. Chainfold and cluster are homologous with ribonucleotide reductase subunit R2 and related enzymes. The two manganese ions and an iron content of about 15% were established by anomalous X-ray diffraction. A comparison of the cluster with more common di-iron clusters suggested an additional histidine in the coordination sphere to cause the preference for manganese over iron. There is no oxo-bridge. The substrate p-amino-benzoate was modeled into the active center. The model is supported by mutant activity measurements. It shows the geometry of the reaction and explains the established substrate spectrum.


SWD-Schlagwörter: Röntgenkristallographie , Proteine , Cystein-Synthase , N-Oxygenase , Biotechnologie
Freie Schlagwörter (deutsch): Strukturanalyse , Cystein-Synthase , N-Oxygenase , Substratspezifität , Anomale Streuung
Freie Schlagwörter (englisch): X-ray , O-acetylserin sulfhydrylase , N-oxygenase , Structure , Function, MAD
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schulz, Georg E. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.06.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 30.08.2007
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