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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-33083
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/3308/


Martin, Anja

Functional analysis of plastid division proteins FtsZ in the moss Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.

Funktionelle Analyse von Plastidenteilungsproteinen FtsZ im Laubmoos Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.

Dokument1.pdf (4.018 KB) (md5sum: 07460a0d80c154d7e6a8ac97a61209e2)

Kurzfassung in Englisch

Plastids as well as prokaryotes divide by binary fission. In prokaryotes, the division process is mediated by the action of the FtsZ (filamentous temperature sensitive Z) protein which forms a contractile ring at the future division site. In plants, homologs of bacterial ftsZ genes have been identified and accumulating evidence suggests a function in plastid division for plant FtsZ proteins.
In this work, the function of Physcomitrella patens FtsZ proteins was investigated. To this end four DeltaftsZ1-1, nine DeltaftsZ1-2, seven DeltaftsZ1-3, five DeltaftsZ1-1/1-3, one DeltaftsZ2-1, five DeltaftsZ2-2, and two DeltaftsZ2 1/2-2 lines were generated. The mutants were analyzed in detail with regard to chloroplast and plant morphology, plant growth and development using molecular and cell biological techniques.
While DeltaftsZ1-1 plants do not show altered chloroplast morphology, DeltaftsZ1-3 plants show enlarged plastids in basal chloronema cells. In contrast, DeltaftsZ1-1/1-3 lines display plastids with drastically altered chloroplast shape in every cell and tissue type. It was therefore concluded that PpFtsZ1-1 and PpFtsZ1-3, which are closely related paralogs, fulfill partially redundant roles in the maintenance of plastid size and shape. Both single knockouts exhibit mild phenotypic aberrations with regard to plant growth and development, suggesting an indirect involvement in processes aside from maintenance of plastid size and shape. For the closely related PpFtsZ2-1 and PpFtsZ2 2 proteins a similar functional redundancy was observed: while DeltaftsZ2-2 plants show WT-like chloroplasts, DeltaftsZ2 1 harbors macrochloroplasts. All plants reveal aberrations at the whole plant level. ΔftsZ2 1/2-2 lines show severely altered leaflet morphology, indicating an involvement of both proteins in processes like cell patterning and leaflet development, which probably require an interaction of FtsZ2-1 and FtsZ2-2 with cytosolic, tissue specific factors. The knockout of the dually targeted ftsZ1-2 led to a plastid phenotype that was distinctly different from those observed in other DeltaftsZ lines and reminiscent of E. coli mutants that undergo a block in cell division. Thus, FtsZ1-2 is regarded as a key component governing plastid division in moss. Moreover, numerous phenotypic aberrations, such as retarded plant growth and development, decreased cell wall thickness, altered cell size and shape, and an impaired gravitropic response were detected. This clearly indicates action of FtsZ1-2 in the cytosol, most probably requiring association to cytoskeletal structures. In contrast to other plant FtsZ proteins, for which a mere involvement in plastid division has been reported, FtsZ1-2 indeed links plastid and cell division, and also participates in the shaping of plant chloroplasts and cells.
Since the observed phenotypes of the FtsZ deficient plants generated in this study suggest the existence of unknown interaction partners, it is imperative to find means for the identification of such factors. For this purpose the application of tandem affinity purification, a method for the isolation of native protein complexes, in P. patens was chosen. C-terminal fusions of FtsZ and the TAP tag under the control of the endogenous promoter were created via allele replacement, an approach that was carried out in P. patens for the first time. Three FtsZ1-2TAP lines, one FtsZ2-1TAP and one FtsZ2 2TAP line were generated and molecular biologically and biochemically characterized. Moreover, the first steps towards an optimized isolation protocol for P. patens were undertaken, pioneering the future establishment of TAP and the subsequent identification of FtsZ interaction partners.


Kurzfassung in Deutsch

Chloroplasten sowie Prokaryonten teilen sich durch Zweiteilung. Der prokaryontische Teilungsprozess wird hauptsächlich durch das Wirken des FtsZ (filamentous temperature sensitive Z) Proteins geprägt, welches einen kontraktilen Ring an der zukünftigen Teilungsebene ausbildet. FtsZ Homologe in Pflanzen wurden identifiziert und Forschungsergebnisse deuten auf eine Rolle bei der Teilung von Chloroplasten hin.
In dieser Arbeit wurden die Funktionen von FtsZ Proteinen im Laubmoos Physcomitrella patens untersucht. Hierzu wurden knockout Mutanten für ftsZ1-1, ftsZ1-2, ftsZ1-3, ftsZ2-1 und ftsZ2-2 sowie Doppelknockout Mutanten für ftsZ1-1/1-3 und ftsZ2-1/2-2 hergestellt. Alle Pflanzen wurden im Hinblick auf Chloroplasten- und Pflanzenmorphologie, Wachstum und Entwicklung mit molekular sowie zellbiologischen Methoden untersucht.
Während DeltaftsZ1-1 Pflanzen keine abweichende Chloroplastenform aufweisen, zeigen DeltaftsZ1-3 Pflanzen vergrößerte Plastiden in basalen Chloronemazellen. Im Gegensatz dazu weisen die Doppelknockout-Mutanten einen dramatisch geänderten Chloroplastenphänotyp in allen Zell- und Gewebetypen auf. Daraus wurde geschlossen, dass PpFtsZ1-1 und PpFtsZ1-3 teilweise redundante Aufgaben bei der Aufrechterhaltung von Plastidengröße und –form erfüllen. Für die eng verwanden Proteine PpFtsZ2-1 und PpFtsZ2-2 wurde eine ähnliche funktionelle Redundanz beobachtet: während DeltaftsZ2-2 Pflanzen Wildtyp-Chloroplasten aufweisen, besitzen DeltaftsZ2-1 Pflanzen Makrochloroplasten und weisen phänotypische Abweichungen bezüglich Zellform und –größe auf. DeltaftsZ2-1/2-2 Pflanzen zeigen eine drastisch geänderte Blattmorphologie, was auf eine Beteiligung beider Proteine an Prozessen wie Musterbildung und Blattentwicklung schließen lässt. Hierzu können Interaktionen mit zytosolischen, gewebespezifischen Faktoren angenommen werden. Die Deletion von ftsZ1-2, welches einem dual targeting unterliegt, führt zu einem Chloroplasten-Phänotyp, der sich eindeutig von denen der anderen DeltaftsZ Mutanten unterscheidet. Die Form der Chloroplasten erinnert stark an E. coli Mutanten, bei denen die Zellteilung blockiert ist. Daher wird FtsZ1-2 als ein Schlüsselprotein für die Chloroplastenteilung in P. patens betrachtet. Außerdem weisen DeltaftsZ1-2 Pflanzen phänotypische Abweichungen wie verlangsamtes Pflanzenwachstum und –entwicklung, reduzierte Zellwanddicke, veränderte Zellgröße und –form sowie einen beeinträchtigten Gravitropismus auf. Dies spricht für Funktionen von FtsZ1-2 im Zytosol, welche wahrscheinlich Assoziierung mit Zytoskelettkomponenten erfordern. FtsZ1-2 verbindet somit Chloroplasten- und Zellteilung und ist beteiligt an der Formgebung von Chloroplasten und Pflanzenzellen.
Da die beobachteten Phänotypen der FtsZ defizienten Pflanzen das Vorhandensein bisher unbekannter Interaktionspartner andeuten, ist es wichtig, geeignete Methoden für die Identifizierung solcher Proteine zu finden. Zu diesem Zweck wurde Tandem Affinity Purification (TAP), eine Methode zur Isolierung nativer Proteinkomplexe, gewählt. C-terminale Fusionen von FtsZ und dem TAP-tag unter der Kontrolle des endogenen ftsZ-Promotors wurden durch allele replacement erstellt. TAP-tag Linien für FtsZ1-2, FtsZ2-1 und FtsZ2-2 wurden generiert und molekular sowie biochemisch charakterisiert. Erste Schritte zur Erstellung eines für P. patens optimierten TAP tag Protokolls wurden unternommen, um die baldige Etablierung der Methode und die Identifizierung von FtsZ Interaktionspartnern in P. patens zu ermöglichen.


SWD-Schlagwörter: Physcomitrella patens
Freie Schlagwörter (deutsch): FtsZ , Plastidenteilung , knockout Mutanten , TAP tag
Freie Schlagwörter (englisch): FtsZ , chloroplast division , knockout mutants , TAP tag
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Kretsch, Thomas (Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.09.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 04.10.2007
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