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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-33242
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/3324/


Clima, Lilia

Application of a new Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) system in synthetic DNA

Anwendung eines neuen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Systems in synthetischer DNA

Dokument1.pdf (1.352 KB) (md5sum: 8791578271aa7ec1977f4fca0a621a76)

Kurzfassung in Deutsch

Die vorgelegte Arbeit beschreibt die Anwendung von neuen, robusten und sehr empfindlichen FRET Systemen in DNA. Die untersuchten Systeme basieren auf Ru(II)-bathophenanthrolin Komplexen als FRET-Akzeptoren und einem Quinolinon Chromophor als FRET-Donor. Der Ru(II)-bathophenanthrolin Komplex konnte in einfachen Schritten in hohen Ausbeuten synthetisiert und gereinigt werden, um ihn anschließend an entsprechende aminomodifizierte Oligonucleotide koppeln zu können. Für die kovalente Fixierung des FRET-Donors an Oligonucleotide via einer post-synthetischen Strategie, wurde das Carbostyril Derivat in eine Carbonsäure überführt, die als N-hydroxysuccinimid-Ester aktiviert wurde. Absorptions- und Emissionsspektren verschiedener Oligonucleotide, welche entweder den Donor- oder den Akzeptor Farbstoff enthielten, zeigten eine gute Spektrale Überlappung der Emissions-Bande des Donors mit der Absorptions-Bande des Akzeptors, eine entscheidende Vorraussetzung für einen starken FRET.
In der ersten Phase der Dissertation lag der Schwerpunkt auf der Synthese von DNA Strängen, welche sowohl mit dem Donor als auch dem Akzeptor über einen post synthetischen Ansatz markiert wurden.
Der FRET-Donor wurde dabei an die Aminofunktion einer 5-(3-Aminoprop-1-ynyl)-2´-desoxyuridin Einheit im synthetisierten Oligonukleotid über eine Amidbindung gekuppelt. Das 5´-Ende des Oligonucleotids, welches ein modifiziertes 5´-Amino-5‘-desoxy Motif enthielt, wurde danach mit dem aktivierten FRET-Akzeptor gekuppelt.
Bei einer verbesserten Markierungsmethode lag das Augenmerk auf einer pre-synthetitischen Strategie, d.h., Einbau des Chromophors in das Oligonucleotid während seiner Synthese an der festen Phase. Dies erforderte die Synthese von zwei speziell modifizierten Bausteinen, die den Donor direkt an die Base, in diesem Fall Uracil bzw. Adenin, gebunden haben. Diese Phosphoramidite liessen sich mit hoher Effizienz während der Festphasensynthese einbauen. Der FRET wurde dann in Einzelstrang DNA untersucht, die Donor, Akzeptor und einen Uridin Rest als Sollbruchstelle zur Spaltung im basischen Medium enthielt. Im ungespalten Oligomeren wurde ein starker FRET beobachtet, der nach der Spaltung nicht mehr zu beobachten war. Alternativ wurde auch noch eine sauer spaltbare Phosphamidbindung als Spaltstelle eingebaut. Aufgrund der langen Abklingzeit für die Fluoreszenz konnten auch zeitaufgelöste Messungen durchgeführt werden.


Kurzfassung in Englisch

The presented work describes the application of new, robust and highly sensitive FRET systems in DNA. The investigated systems are based on a Ru(II) -bathophenanthroline complex as FRET-acceptor and quinolinone derivative as FRET-donor. The Ru (II)-bathophenanthroline complex was synthesized by a straightforward route in high yield for the coupling to corresponding amino-modified oligonucleotides. For the covalent attachment of the FRET-donor to oligonucleotides via a post-synthetic strategy, the carboxyl function of the carbostyril derivative was activated as N-hydroxysuccinimid-ester. The absorption and emission spectra of separate oligonucleotides bearing either only the donor or the acceptor chromophore showed a good spectral overlap, a crucial requirement for a strong FRET.
The first part of the current thesis was focused on the labelling of DNA with both chromophores by a post synthetic approach.
The FRET-donor was attached to a 5-(3-aminoprop-1-ynyl)-2’-deoxyuridine unit via an amide bond. The 5’-end of the oligonucleotides consisting of a modified 5’-amino-5’-deoxy unit was then coupled to the activated FRET-acceptor.
An improved labelling method focussed on a pre-synthetic strategy, i.e., incorporation of the chromophore molecules into oligonucleotides during their chemical synthesis on solid support. This required the synthesis of two special building blocks in which the donor chromophore was attached to uracil or adenin, respectively. Both phosphoramidites could be introduced with high efficiency during solid phase synthesis. Since it was also possible to incorporate the Ru-complex during the solid phase approach, the whole procedure for the incorporation of the FRET into synthetic DNA is straightforward and very efficient. The FRET was investigated in single stranded DNA bearing donor, acceptor and an uridine moiety as specific cleavage site. In the intact fragment a high FRET could be observed which diminished after cleavage under basic conditions. As an alternative potential cleavage site to be broken under acidic conditions, we have inserted a phosphamide bond. Due to the long decay time of the fluorescence of the Ru complex, time-resolved measurements could also be carried out successfully.


SWD-Schlagwörter: Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer , DNA, modifizierte phosphoramidite, Ru(II)-bathophenanthrolin Komplex
Freie Schlagwörter (englisch): Fluorescence Resonance Energy Transfer, DNA, modified phosphoramidites, Ru(II) -bathophenanthroline complex
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bannwarth, Willi (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.10.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 17.10.2007
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