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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-35539
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/3553/


Füller, Florian

Posttranslationale Modifizierung von Rho-GTPasen zur Charakterisierung der Substraterkennung und Substratspezifität des Yersinia enterocolitica outer Proteins YopT

Substrate recognition and substrate specificity of the Yersinia enterocolitica outer protein T (YopT) for Rho GTPases

Dokument1.pdf (7.782 KB) (md5sum: 68e37ec915bae41a6e0e6a47c9948802)

Kurzfassung in Deutsch

Das Yersinia outer Protein YopT aus Y. enterocolitica ist eine 35,5 kDa große Cystein-Protease, die über ein Typ-III-Sekretionssystem in das Zytosol der Wirtszelle injiziert wird. Die Infektion von YopT-produzierenden Yersinien führt zu einem zytotoxischen Effekt, der sich im Auflösen des Aktin-Zytoskeletts und im Abrunden der Zellen manifestiert. YopT schneidet direkt vor dem C-terminalen Cystein der membran-gebundenen GTPasen RhoA, Rac und Cdc42 was zur Translokation der GTPasen ins Zytosol und zu ihrer Inaktivierung führt. Zur Lokalisation an Membranen werden GTPasen mit C-terminaler CAAX-Box (C, Cystein; A, aliphatische AS; X, beliebige AS) posttranslational, katalysiert durch die GGT-I (Geranylgeranyltransferase-I) am Cystein isoprenyliert. In den darauf folgenden Schritten der posttranslationalen Modifizierung erfolgt die endoproteolytische Spaltung des –AAX-Tripeptides durch RCE1 (Ras-converting enzyme 1) und die IcMT-katalysierte (Isoprenylated cysteine methyltransferase) Methylierung der Carboxylgruppe des Cysteins.
Die einzelnen Schritte der posttranslationalen Modifizierung der GTPasen sind für die Substraterkennung von YopT von entscheidender Bedeutung. 1. Die Isoprenylierung ist für die YopT-katalysierte Proteolyse essentiell. Nicht-isoprenyliertes RhoA wird von YopT nicht proteolytisch gespalten. 2. Die endoproteolytische Spaltung des –AAX-Tripeptides von RhoA ist notwendige Voraussetzung für die YopT-katalysierte Proteolyse. Nach Mikroinjektion in Rce1(-/-)-Zellen mit YopT konnten keine morphologischen Veränderungen beobachtet werden. Zusätzlich führt die Inkubation von Rce1(-/-)-Membranen mit YopT nicht zur Translokation von RhoA in den Überstand. YopT bindet zwar an isoprenyliertes RhoA-CAAX, die Proteolyse wird jedoch durch die Anwesenheit des –AAX-Tripeptides aus sterischen Gründen blockiert. 3. Mikroinjektionsstudien und Translokationsuntersuchungen in Icmt(-/-)-Zellen zeigten, dass die Methylierung des Cysteins von RhoA für die YopT-Katalyse nicht notwendig ist.
Zur Untersuchung, welche Faktoren die YopT-katalysierte Proteolyse der GTPasen beeinflussen wurde die posttranslationale Modifizierung in vitro etabliert.
Dazu wurden folgende Schritte durchgeführt: 1. Die GGT-I wurde in E. coli-Zellen exprimiert und die enzymatische Aktivität durch Bestimmung des Km-Wertes für RhoA ermittelt. Gleichzeitig wurde die maximale Geranylgeranylierung für RhoA, Rac und Cdc42 bestimmt. 2. Die Transmembranproteine RCE1 und IcMT wurden unter Verwendung des Baculovirussystems in Sf9-Zellen exprimiert. Zur Ermittlung der enzymatischen Aktivität der aufgereinigten IcMT-Membranen wurden die Km-Wert der künstlichen Substrate AFC und AGGC bestimmt. 3. Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität von aufgereinigten RCE1-Membranen wurde indirekt durch die Methylierung von RhoA durch IcMT ermittelt. Nur nach endoproteolytischer Spaltung des –AAX-Tripeptides durch RCE1 ist die Methylierung des Cysteins durch IcMT möglich.
Nach Etablierung der posttranslationalen Modifizierung in vitro wurden die Anforderungen der GTPasen im Bezug auf die YopT-katalysierte Proteolyse untersucht. Die YopT-katalysierte Proteolyse von RhoA ist unabhängig vom Beladungszustand der GTPase. Bei der Untersuchung des Einflusses der Isoprenlänge von RhoA auf die Katalysegeschwindigkeit von YopT konnte gezeigt werden, dass farnesyliertes RhoA von YopT schneller umgesetzt wird als geranylgeranyliertes RhoA. Zur Charakterisierung des Einflusses der polybasischen Region von RhoA, Rac und Cdc42 wurden die GTPasen in vitro posttranslational modifiziert und die proteolytische Spaltung durch YopT untersucht. Es konnte ermittelt werden, dass RhoA bevorzugtes Substrat von YopT ist. Im Vergleich dazu verläuft die proteolytische Spaltung von Rac und Cdc42 langsamer. Während in Rac und Cdc42 die polybasische Region direkt an die CAAX-Box anschließt, befindet sich in RhoA ein Glycin (G189, Position P1) bzw. ein Serin (S188 Position P2) zwischen der CAAX-Box und der polybasischen Region. Diese beiden Aminosäuren beeinflussen die YopT-katalysierte Proteolyse von RhoA entscheidend. Die proteolytische Spaltung durch YopT der Deletionsmutante RhoA∆189 verläuft im Vergleich zu RhoA-Wildtyp schneller. Dem gegenüber führt die Deletion von Serin und Glycin (RhoA∆188/∆189) nur noch zu einem geringen Umsatz der GTPase durch YopT, vergleichbar mit Rac und Cdc42.
Zur Untersuchung der YopT-Wirkung auf den RhoA-GDI-Komplex, konnte in Abhängigkeit des Beladungszustandes von RhoA gezeigt werden, dass GTP-gebundenes RhoA im RhoA-GDI-Komplex durch YopT modifiziert wird. Wogegen die YopT-katalysierte Proteolyse von GDP-RhoA im RhoA-GDI-Komplex nur zu einem minimalen Umsatz führt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit ergänzen und erweitern die Kenntnisse der Substraterkennung und der Substratspezifität des Yersinia outer Proteins YopT und tragen zum Verständnis der pathogenen Wirkung von YopT während der Infektion in der Wirtszelle bei.


Kurzfassung in Englisch

The Yersinia outer protein YopT from Y. enterocolitica is a 35,5 kDa big cysteine protease, which is translocated by a type III secretion system (TTSS) into the cytosol of host cells. Infection with a mutant of Y. enterocolitica secreting only YopT leads the disruption of the actin cytoskeleton and rounding of the host cells. YopT cleaves directly in front of the C-terminal cysteine of the membrane bound GTPases RhoA, Rac and Cdc42. The cleavage leads to the translocation of the GTPases into the cytosol and to their inactivation. Small GTPases harboring a C-terminal CAAX-box (C, cysteine; A, aliphatic residue, X, any residue) are posttranslationally modified. After isoprenylation of the cysteine by the geranylgeranyl transferase type I (GGT-I), the –AAX tripeptide is cleaved off by RCE1 (ras converting enzyme 1). In a final step the carboxylat anion of the geranylgeranylated cysteine is methylated, a reaction catalyzed by IcMT (Isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase).
The substrate recognition of YopT is influenced by the single steps of the posttranslational modification of the GTPases. 1. The Isoprenylation of GTPases is essential for the YopT-induced cleavage. Non isoprenylated RhoA is not cleaved by YopT. 2. The cleavage of the
–AAX-tripeptide is required for YopT-catalysed proteolysis. Microinjection of Rce1 deficient fibroblasts had no impact on the subcellular localization of RhoA and no impact on cell morphology. 3. To determine if carboxyl methylation is also required for YopT action, Icmt-deficient fibroblasts were microinjected with YopT. In contrast to the results with Rce1-deficient cells, YopT cleaved RhoA and caused rounding up of the Icmt-deficient cells. The data demonstrate that Rce1-mediated removal of –AAX from isoprenylated Rho GTPases is required for the proteolytic activity of YopT in living cells, whereas carboxyl methylation by Icmt is not.
Moreover, it is suggested that the polybasic regions of the GTPases are necessary and sufficient for YopT-induced recognition and cleavage. To analyse the substrate specificity of YopT the posttranslational modification of GTPases in vitro was established. GGT-I was expressed in E. coli. RCE1 and IcMT were expressed with the baculovirus system in Sf9 cells. After establishing the posttranslational modification the requirement of the GTPase for YopT cleavage was determined. YopT does not distinguish between the conformations of its substrate. Isoprenylation of Rho GTPases can encompass two different forms of lipid modification: Farneslyation or geranylgeranylation. YopT prefers farnesylated RhoA. To further characterise the influence of the polybasic region of RhoA, Rac and Cdc42 the GTPases were posttranslationally modified and incubated with YopT. The YopT-catalysed cleavage of RhoA is preferred, the proteolysis is more efficient compared to Rac and Cdc42. Cleavage of Rac and Cdc42 is comparable. In Rac and Cdc42 the polybasic region is directly connected to the CAAX-Box. In RhoA however there are a serine (S188, position P2) and glycin (G189, position P1) between the polybasic region and the CAAX-Box. These amino acids influence the YopT-catalysed cleavage of RhoA. The proteolytic cleavage of RhoA∆189 is faster compared to RhoA-wildtype. The deletion of serine and glycin in RhoA (RhoA∆188/∆189) leads to a reduced cleavage of the GTPase by YopT, comparable with Rac and Cdc42. Additionally it could be shown that YopT can cleave GTP loaded RhoA in the Rho-GDI-complex, whereas GDP loaded RhoA in the Rho-GDI-complex is only minimally cleaved.


SWD-Schlagwörter: Rho-Proteine , Bakteriengift
Freie Schlagwörter (deutsch): Bakterielle Toxine, YopT, Rho-GTPasen, posttranslationale Modifizierung
Freie Schlagwörter (englisch): Bacterial toxins, YopT, Rho GTPases, posttranslationale modification
Institut: Inst. für Pharmakologie und Toxikologie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schubert, Rolf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.10.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 22.11.2007
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