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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-37996
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/3799/


Schnell, Hans-Jörg

Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese der Phenalinolactone aus Streptomyces species Tü6071

Biomolecular and biochemical investigations on the phenalinolactone biosynthesis (Streptomyces species Tü6071)

Dokument1.pdf (4.012 KB) (md5sum: 84a16e0ba48e370d74c71eefe3b5ea7d)

Kurzfassung in Deutsch

Bei der Substanzgruppe der Phenalinolactone handelt es sich um glykosylierte, antibakteriell aktive Stoffe terpenoiden Ursprungs. Das hervorzuhebende Strukturmerkmal ist ein stark oxidiertes gamma-Butyrolacton, dessen Ursprung nach wie vor ungeklärt ist. Das Gencluster zur Biosynthese der Phenalinolactone umfasst 35 potentielle Gene, welche über circa 42.000 Basenpaare verteilt vorliegen (darunter die Gene zur eigentlichen Biosynthese, zur Regulation und zur Resistenzbildung). Um den Verlauf der Biosynthese aufzuklären, wurden drei experimentell verschiedene Methoden angewendet:

a) Experimente zur gezielten Gen-Inaktivierung
Gene, welche an der Biosynthese des Grundgerüstes (plaT1, plaT2, plaT3 und plaZ) beteiligt sind und Gene, die für Cytochrom P450 Monooxygenasen kodieren (plaO2, plaO3 und plaO5) wurden inaktiviert. Die Produktionsspektren der generierten Mutanten wurden auf neue Phenalinolactone und Intermediate der Biosynthese untersucht. Diese neuen Substanzen dienten der Her- und Ableitung der Biosynthese. Es konnte ein Großteil der Biosynthese der Hauptmetabolite Phenalinolactone A und D aufgeklärt werden.

b) Fütterungsexperimente mit 13C markierten Vorstufen verbreiteter Biosynthesewege
Durch Fütterung diverser Vorstufen, welche mit dem stabilen Isotop 13C markiert waren, konnten die Biosynthese des Grundgerüstes, einzelne Kohlenstoffatome und auch funktionelle Einheiten der Phenalinolactone bestimmten Biosynthesewegen und biosynthetischen Ursprüngen zugeordnet werden.

c) Biochemische Experimente
Drei Cytochrom P450 Monooxygenasen (PlaO3HisTag , PlaO4HisTag und PlaO5HisTag) konnten in löslicher Form isoliert werden. Mit dem rekombinanten Protein PlaO5HisTag wurde erfolgreich eine in vitro Umsetzung durchgeführt.


Kurzfassung in Englisch

Phenalinolactones are novel terpene glycosides with antibacterial activity. A striking structural feature is the highly oxidized gamma-butyrolactone of elusive biosynthetic origin. The biosynthetic cluster is spanning a 42.000 bp region with 35 candidate genes (biosynthetic, regulatory and resistance conferring functions). To rule out the course of the biosynthesis of the phenalinolactones, three experimentally different approaches were chosen:

a) Targeted gene inactivation
Targeted gene inactivations were carried out to specifically manipulate the phenalinolactone pathway. Genes corresponding with the formation of the backbone of the phenalinolactones (plaT1, plaT2, plaT3 and plaZ) and cytochrome P450 monooxygenase genes (plaO2, plaO3 und plaO5) were inactivated. The mutants’ production media were screened for new intermediates and derivatives. These new derivatives were used to deduce a major part of the phenalinolactones’ A and D biosynthesis.

b) Feeding experiments with stable isotopes (13C)
Through feeding experiments with stable isotopes (13C) the “Rohmer” pathway for isoprene (IMPP / DMAPP) synthesis was assigned. Additionally it was attempted to get more information about the origin of the -butyrolactone by these feedings.

c) Biochemical investigations
Soluble CYP450 monooxygenases (PlaO3HisTag , PlaO4HisTag and PlaO5HisTag) were isolated. The recombinant enzyme PlaO5HisTag was used in an in vitro assay to convert PL D to PL A.


SWD-Schlagwörter: Streptomyces , Biosynthese , Terpene , Terpenderivate , Naturstoff , Sekundärmetabolit , Geninaktivierung
Freie Schlagwörter (deutsch): Protein-Assay, CYP 450
Freie Schlagwörter (englisch): streptomyces, biosynthesis, terpene, terpene derivatives, natural compound, secondary
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.12.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 13.12.2007
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