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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-44940
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/4494/


Schwenk, Jochen

Proteomanalyse von Kv4-Kanälen und Strukturuntersuchung des assoziierten Proteins KChIP4a

Proteome analysis of Kv4 channel complexes and structural characterization of the associated protein KChIP4a

Dokument1.pdf (4.394 KB) (md5sum: f038a4028fe01fa85f07eba9392d60b5)

Kurzfassung in Deutsch

Kv4 Kaliumkanäle spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation elektrischer Erregbarkeit in Neuronen. Ihre Funktion wird dabei maßgeblich von ihrer molekularen Umgebung, insbesondere durch assoziierte Proteine beeinflusst.
Um diese sogenannten Mikrodomänen von Kv4 Kanälen zu charakterisieren und neue Interaktionspartner zu identifizieren wurde auf Basis der Affinitätsreinigung ein neuer Ansatz zur Analyse des Kv4 Proteoms entwickelt und angewandt. In einem „Screening“ - Verfahren wurden die für die Solubilisierung von Kv4 Membranproteinkomplexen aus Hirnmembranen optimalen Pufferbedingungen experimentell bestimmt. Diese wurden dann genutzt, um mit Kv4-spezifischen Antikörpern Affinitätsreinigungen in Membranen aus Maus- und Rattenhirn durchzuführen. Die Identifizierung aller assoziierten Proteine erfolgte mit Hilfe der Massenspektrometrie (MS). Semi-quantitative Auswertungen der MS-Daten waren essentiell bei der Bewertung der Ergebnisse. Insgesamt konnten in den Kv4.2 und Kv4.3 Mikrodomänen 15 bzw. 29 neue Interaktionspartner gefunden werden.

KChIP4a nimmt als Kv4-assoziiertes Protein eine Sonderstellung ein, da diese Isoform der KChIP-Proteine als einzige die schnelle Inaktivierung der Kv4 Kanäle aufhebt und die effiziente Rekrutierung der Kanäle an die Plasmamembran verhindert. Mit NMR-spektroskopischen Verfahren wurde KChIP4a strukturell charakterisiert. Hierzu wurde KChIP4a in E.coli exprimiert, isotopenmarkiert und in einem mehrstufigen Verfahren im mg-Maßstab gereinigt. Anhand der NMR-spektroskopischen Untersuchungen war es möglich, die Lösungsstruktur von KChIP4a zu charakterisieren, die zu einer im Laufe dieser Arbeit publizierten Kristallstruktur von KChIP1 sehr ähnlich ist. Der funktionell wichtige N-Terminus des KChIP4a, die sogenannte KIS-Domäne, ist strukturell in zwei Bereiche zu unterteilen. Von Position 29-44 erstreckt sich ein sehr flexibler Linker an der Oberfläche des Proteins. Der Bereich von Aminosäure 4-24 bildet hingegen eine a-Helix.
Mit diesen Strukturinformationen ist es möglich, die verringerte Oberflächenexpression des Kv4 Kanals in Anwesenheit von KChIP4a zu erklären.


Kurzfassung in Englisch

The Kv4 channel family is responsible for rapidly inactivating (A-type) voltage-gated K+ currents in neurons and shape postsynaptic responses to excitatory input. Proteom analysis of Kv4 channels by affinity purification from a plasma-membrane enriched protein fraction from total rat brain as well as mouse brain enable the characterization of the so called microdomains of these channels.
K+ channel-interacting proteins (KChIPs), members of the recoverin/NCS1 family of EF-hand calcium-binding proteins, specifically interact with Kv4 voltage-operated K+ channels and modulate both channel gating and protein trafficking. It is known that KChIPs are integral components of native Kv4 channels and colocalize with Kv4 subunits in the brain. Different from the other KChIPs, KChIP4a removes rapid inactivation and reduces dramatically the surface expression of the Kv4 channels by virtue of its N-terminus. Using heteronuclear NMR spectroscopy on triple-labeled KChIP4a from a bacterial expression system it was possible to characterize its solution structure and thereby explain the molecular mechanism which is reponsible for the reduced surface expression of the Kv4 channel in the presence of KChIP4a.


SWD-Schlagwörter: Kv4 Kanäle , Proteomanalyse
Freie Schlagwörter (englisch): Kv4 channel , proteome analysis
Institut: Physiologisches Inst. II
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Fakler, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.02.2007
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 25.02.2008
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