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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-46928
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/4692/


Sandrock, Kirstin

Identifizierung und Charakterisierung neuer Interaktionspartner von Rac-GTPasen

Identification and characterization of novel interaction partners for Rac GTPases

Dokument1.pdf (6.076 KB) (md5sum: 99e31f2ee80f57f5e0f6be7fbb029337)

Kurzfassung in Deutsch

Rho-Proteine spielen eine große Rolle in physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, indem sie zum Beispiel das Aktin-Zytoskelett, die Zellzyklusprogression und die Aktivität von Transkriptionsfaktoren regulieren. Als molekulare Schalter wechseln die kleinen GTPasen zwischen einem inaktiven GDP-gebundenen und einem aktiven GTP-gebundenen Zustand. Zu einer Unterfamilie der Rho-Familie kleiner GTPasen zählen die Rac-Proteine. Obwohl die drei Rac-Isoformen zwischen 89 und 93% Sequenzidentität aufweisen, regulieren sie verschiedene zelluläre Funktionen und interagieren zum Teil mit spezifischen Effektoren.
Die GTPase Rac1 beeinflusst vielfältige zytosolische Funktionen, jedoch deuten Studien in den letzten Jahren an, dass das Vorkommen von Rac1 im Zellkern zusätzliche nukleäre Funktionen nahelegt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System etabliert, um von Rac1 und Rac3 neue Interaktionspartner in einer HeLa cDNA-Bibliothek zu identifizieren. Als ein spezifischer Interaktionspartner von Rac1 konnte Karyopherin alpha 2 (KPNA2) nachgewiesen werden. Unter den Karyopherinen gibt es Importine und Exportine, die jeweils den Proteintransport in und aus dem Zellkern regulieren. KPNA2 gehört zu der alpha Importin-Familie, dessen Mitglieder als Adapterproteine den Komplex mit Importin beta 1 und einem NLS (Kernlokalisationssignal)- haltigen Importsubstrat vermitteln.
Zunächst wurde mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems die Interaktion zwischen Rac1 und KPNA2 charakterisiert. Es wurde nachgewiesen, dass KPNA2 Isotyp-spezifisch mit Rac1, nicht aber mit Rac2 und Rac3 interagiert. Die Bindung wird durch das NLS-Motiv des Rac1–Proteins vermittelt, das unter den drei Rac-Isoformen nur in der C-terminalen polybasischen Region (PBR) von Rac1 zu finden ist. Dieses NLS-Motiv macht die Spezifität der Rac1/KPNA2-Interaktion aus und ist essentiell für den Kernimport. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen Rac1 und KPNA2 unabhängig vom Aktivierungszustand der kleinen GTPase erfolgt. Für die nukleäre Translokation ist jedoch die Aktivierung von Rac1 erforderlich, wie sich bei der verstärkten Akkumulation der konstitutiv aktiven Rac1-Mutante im Nukleus zeigte. Darüber hinaus konnte für das endogene Rac1-Protein ebenfalls eine verstärkte Translokation vom Zytoplasma in den Nukleus gezeigt werden, nachdem es mit dem bakteriellen Toxin CNF1 (zytotoxisch nekrotisierender Faktor 1) aktiviert und gleichzeitig dessen proteasomale Degradation inhibiert wurde. Bemerkenswert war die, parallel zu Rac1 erscheinende, sehr starke Akkumulation von KPNA2 im Zellkern. Diese starke Kernlokalisation von KPNA2 konnte ebenfalls in HeLa-Zellen nachgewiesen werden, die die konstitutiv aktive Rac1-Mutante exprimierten. Im Gegensatz dazu wurde durch die Expression von dominant negativem Rac1 die Anreicherung von KPNA2 im Nukleus, nach Behandlung der Zellen mit CNF1 und dem Proteasominhibitor, vollständig aufgehoben.
Um nachzuweisen, dass die nukleäre Lokalisation von Rac1 direkt durch KPNA2 beeinflusst wird, wurden KPNA2 siRNA-Oligonukleotide verwendet. Die zelluläre Konzentration von KPNA2 konnte um 80% reduziert werden. In den KPNA2 „knock-down“- Zellen war die verstärkte nukleäre Translokation von Rac1, nach Inkubation mit CNF1 und dem Proteasominhibitor, vollständig inhibiert.
Auf Grundlage der vorliegenden Untersuchungen lässt sich folgendes Modell des Kernimports von Rac1 aufstellen: Die nukleäre Translokation der kleinen GTPase erfordert sowohl die direkte Interaktion mit dem Kernimportrezeptor KPNA2 als auch die Aktivierung von Rac1. Die Kernlokalisation ermöglicht Rac1 in nukleäre Signaltransduktionswege oder in die Transkription verschiedener Gene einzugreifen. Da der Kernimport von Rac1 eine wesentliche Voraussetzung für dessen Abbau im Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist, wird im Zellkern offensichtlich die Rac1-Degradation eingeleitet.
Ein weiterer Interaktionspartner von Rac, der mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System identifiziert wurde, ist das POSH (plenty of SH3s) –Homolog POSH2a sowie eine neue Spleißvariante POSH2b. Die Funktionen der beiden neuen Proteine sind im Augenblick erst ansatzweise charakterisiert. Die Interaktion von POSH2a und POHS2b konnte mit den Rac-Isoformen Rac1 und Rac3 nachgewiesen werden. Weiterhin wurde deutlich, dass die POSH2-Proteine ausschließlich mit der aktiven GTP-beladenen Form von Rac interagieren. Zusammenfassend führen die Ergebnisse zu der Annahme, dass es sich um bislang unbekannte Rac-Effektoren handelt, die neue Zielproteine in Rac-Signalwegen darstellen könnten.


Kurzfassung in Englisch

Rho proteins participate in a broad range of physiological and pathophysiological processes, including the regulation of the actin cytoskeleton, cell cycle progression, and gene transcription. These GTPases represent molecular switches that cycle between a GDP-bound inactive and a GTP-bound active state. Rac proteins belong to a subfamily of Rho GTPases. Although the three isoforms share between 89 and 93% sequence identity, they are involved in different physiological functions and interact with a specific subset of effectors.
Recent data point out that the small GTPase Rac1 is not only involved in multiple cytosolic functions but also translocates to the nucleus to perform further tasks. This work shows the application of the yeast two-hybrid system to identify novel interaction partners of Rac1 and Rac3 from a HeLa cDNA library. The nuclear import receptor karyopherin alpha 2 (KPNA2) could be identified as a specific interaction partner of Rac1. The karyopherin family comprises importins and exportins, which regulate the nuclear import and export, respectively. As a member of the alpha importins, KPNA2 is an adaptor protein that recognizes cargo proteins containing a nuclear localization signal (NLS) and which also interacts with importin beta 1, the transport receptor.
The interaction between Rac1 and KPNA2 was initially characterized in the yeast two-hybrid system showing that KPNA2 interacts specifically with Rac1, but not with Rac2 or Rac3. The C-terminal polybasic region of Rac1 contains a NLS, whereas Rac2 and Rac3 lack a functional NLS. The presence of the NLS in Rac1 determines the specificity of the interaction and is a prerequisite for the nuclear import. Although this interaction is independent of the Rac1 GDP/GTP-loading, the nuclear import of Rac1 requires its activation. A nuclear enrichment was shown for the constitutive active Rac1 mutant. Furthermore, the activation of Rac1 via the cytotoxic necrotizing factor 1 (CNF1) and the concurrent inhibition of its proteasomal degradation also result in the nuclear accumulation of Rac1. Somewhat surprisingly, this treatment of HeLa cells leads to a strong accumulation of KPNA2 in the nucleus in parallel to Rac1. Obviously, the subcellular distribution of the import receptor KPNA2 is substantially influenced by active Rac1. The strong nuclear accumulation of KPNA2 is also evident from HeLa cells transfected with constitutive active Rac1. In contrast, the incubation with CNF1 and the proteasome inhibitor of cells transfected with dominant negative Rac1 does not show the enhanced nuclear staining of KPNA2.
If the nuclear import of Rac1 depends on the interaction with KPNA2, the cellular knock-down of KPNA2 should diminish this transport process. The application of the KPNA2 siRNA oligonucleotides effectively reduced the KPNA2 protein level up to 80%. As a consequence, the low KPNA2 expression prevented the increased nuclear transport of Rac1 following CNF1 and proteasome inhibitor incubation.
These data propose the following model for the nuclear import of Rac1: The specificity for the nuclear import is determined by the KPNA2–Rac1 interaction, but the actual initiation of the transport requires the activation of Rac1. In the nucleus, Rac1 may participate in a variety of signalling pathways and gene transcription. Furthermore, Rac1 may be prepared for its proteasomal degradation in the nucleus, because the nuclear localization is a precondition for its degradation within the ubiquitin-proteasome-system.
The yeast two-hybrid system revealed additional Rac interaction partners, like the POSH (plenty of SH3s) homologue POSH2a as well as the splice variant POSH2b. The physiological functions of both novel POSH2 proteins are not described yet. POSH2a and POSH2b both bind to Rac1 and Rac3 whereas the interaction depends on the active GTP-bound state of the small GTPase. In summary, the data demonstrate so far unknown Rac effectors that may provide new target proteins in Rac signal transduction pathways.


SWD-Schlagwörter: GTPasen , Kernimport , Karyopherin , Hefe-Zwei-Hybrid System
Freie Schlagwörter (englisch): GTPases , nuclear import , karyopherin , yeast two-hybrid system
Institut: Inst. für Pharmakologie und Toxikologie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.02.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 19.03.2008
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