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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-49189
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/4918/


Willemsen, Thomas

Proteinfragment-Komplementierungssassay zur Charakterisierung und spezifischen Inhibition natürlicher Protein-Protein Interaktionen am Beispiel von AF10

Protein fragment complementation assays for characterization and specific inhibition of natural protein-protein interactions of AF10

Dokument1.pdf (2.689 KB) (md5sum: 8e5859af4b5c99f9cb942301c515c656)

Kurzfassung in Deutsch

Das Coiled Coil ist eines der häufigsten und wichtigsten Proteinmotive. Es besteht natürlicherweise aus zwei bis fünf Helices, die umeinander gewunden sind und dadurch eine Superhelix ausbilden. Die einzelnen Helices sind aus einem wiederkehrende Muster von sieben Aminosäuren aufgebaut, dem sogenannten Heptaden-Repeat. Als Protein-Interaktionsdomäne ist das Coiled Coil oftmals ein wichtiger Bestandteil komplexer, fein aufeinander abgestimmter Netzwerke. In vielerlei Krankheiten ist das Gleichgewicht solcher Netzwerke durch Fehlregulation von Coiled Coil-Proteinen gestört.
Ein Beispiel hierfür ist der Transkriptionsfaktor AF10, dessen Coiled Coil-Domäne auf DNA-Ebene durch Chromosonen-Translokation an MLL und CALM fusioniert werden kann, was zu bestimmten Typen von akuter Leukämie führt. Um die durch die Fehlregulation verursachte molekularbiologischen Veränderungen zu verstehen und auch zu unterbinden, wurden in dieser Arbeit zunächst die Interaktionen von AF10 mit seinen wildtypischen Bindungpartnern untersucht. In folgenden Schritten wurden Peptide selektioniert, die als dominant-negative Inhibitoren an die AF10 Coiled Coil-Domäne binden sollen.
Als wichtigstes Werkzeug dienten in dieser Arbeit die Proteinfragment-Komplementierungsassays (PCA) mit deren Hilfe Protein-Protein-Interaktionen untersucht und stärkere Bindungspartner aus einer genetisch codierten Peptid-Bibliothek selektioniert wurden. Im PCA werden Dimerisierungsdomänen an je ein Fragment eines Reporterproteins fusioniert und nur durch Interaktion dieser Dimerisierungsdomänen kommt es zur Resassemblierung des Reporterproteins, angezeigt durch dessen Aktivität.
Zur Durchführung der PCAs wurde ein flexibles Vektorsystem entworfen und kloniert, das den schnellen Austausch der verschiedenen Komponenten eines Assays erlaubt. Mit Hilfe dieses Systems wurden zwei PCAs, mit muriner Dihydrofolatreduktase (mDHFR) bzw. β-Lactamase als Reporterprotein, erfolgreich im Labor etabliert. Beim β-Lactamase-PCA gab es verschiedene Möglichkeiten eine Coiled Coil-Domäne an die Fragmente des Enzymes zu fusionieren. Als beste Variante erwies sich die Fusion des ersten Fragmentes an den N-Terminus und des zweiten Fragmentes an den C-Terminus der Coiled Coil-Helices. Zusätzlich wurde die Möglichkeit untersucht, einen PCA für trimere Interaktionen zu entwickeln. Es zeigte sich, dass dazu ein Reporterprotein gefunden werden muß, das sich in drei Fragmente spalten läßt oder ein geeignetes Heterotrimer, das ausschließlich durch Oligomerisierungsdomänen zusammenfindet.
Mittels mDHFR-PCAs wurde die Bindung der Coiled Coil-Domäne von AF10 (As 755 – 796) an seine wildtypischen Partner GAS41 und hDOT1L, deren Coiled Coil-Regionen deutlich länger sind, analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass AF10 mit dem vierten Register von GAS41 (As 186 – 227) sowie etwas schwächer auch mit dem dritten Register (As 179 – 220) interagiert. Bei Messungen mit dem Spektropolarimeter, war aber das Dimer aus AF10 und dem dritten Register von GAS41 stabiler. Im Falle des hDOT1L bindet AF10 an das zweite Register der dritten Coiled Coil-Domäne (As 608 – 649), jedoch ist die Interaktion nur schwach.
Basierend auf der besten Interaktion im PCA, der Bindung des vierten Registers der Coiled Coil-Domäne von GAS41, wurde eine Peptidbibliothek generiert und die entsprechende DNA-Sequenz kloniert. Aus dieser wurden neue Bindungspartner für AF10 selektioniert. Im mDFHR-PCA wurden die beiden Sequenzen AF10win und AF10win2, im β-Lactamase-Assay Blacwin1 und 2 selektioniert. Die Gewinner des mDHFR-PCAs waren dabei aufgrund einer Deletion reproduzierbar N-terminal verkürzt, obwohl dies in der Ausgangsbibliothek nicht vorangelegt war. AF10 erwies sich insgesamt als problematisch im mDHFR-Assay. Möglicherweise ist ein Fusionsprotein aus AF10 und einem der DHFR-Fragmente unverträglich für die Bakterienzellen. Im β-Lactamase-Assay, der im Periplasma lokalisiert ist, wurden dagegen Sequenzen von normaler Länge selektioniert. Bei einem Austausch der selektionierten Sequenzen zwischen den Systemen blieb die Interaktionstärke in einem anderen PCA als dem, der zur Selektion verwendet wurde, hinter den Erwartungen zurück. Dies belegte einen Einfluß des Systems auf den Selektionsprozess, der unter idealen Umständen nicht vorkommen sollte. Auch die unterschiedlichen Bedingungen der Assays im Cytosol bzw. Periplasma mag eine Rolle gespielt haben.
Durch das Studium der untersuchten Interaktionen und der selektionierten Peptide hat sich das Verständnis von Interaktionen in natürlichen Coiled Coil Sequenzen verbessert. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden daher als Ausgangspunkt für die Entwicklung noch stärker mit AF10 interagierender Inhibitoren dienen, die schließlich den Einfluss der AF10 Fusionsproteine auf die Leukämie-Entstehung aufklären helfen und möglicherweise Wege für neue Therapiemöglichkeiten aufdecken werden.


Kurzfassung in Englisch

Protein Fragment Complementation Assays for Characterization and Specific Inhibition of Natural Protein-Protein Interactions of AF10

The coiled-coil motif is one of the most abundant protein-protein interaction domains. The most common coiled coil consists of two or more α-helices, built from repeating heptads, wrapped around each other in a left-handed super coil. The basic unit of a coiled-coil helix is a repeating motif of seven amino acids called the heptad repeat. Coiled coils occur in virtually every physiological system because of their ability to function with high specificity in a fine-tuned network of homo- and heterotypic interactions. In many diseases, these networks are disturbed by deregulation of coiled coil proteins.
One example is the transcription factor AF10, where the C-terminal part of AF10 is fused at the genetic level to the N-terminal part of MLL or CALM by chromosomal translocation. Importantly, in all cases the coiled-coil domain of AF10 is found to be a major player in leukemogenesis. This study focuses on the AF10 coiled coil by characterizing binding to native partners as well as by developing interfering peptides that permit functional inhibition of the AF10 coiled coil domain.
A powerful tool for studying protein-protein interactions are Protein-fragment Complementation Assays (PCA). They have also been used in protein engineering for selecting tightest binding partners from peptide libraries. For PCA selection, a peptide library and the target protein or a domain thereof is fused to a reporter protein that is dissected into two non-functional fragments. Interactions of the studied proteins or domains are demonstrated by restoration of the reporter proteins functionality.
A flexible vector system was developed and cloned. It contained several unique, strategically placed restriction sites for easy cloning and exchange or deletion of components for PCAs or protein expression. These vectors were used for establishing PCAs with murine dihydrofolate reductase (mDHFR) and β-lactamase as reporter proteins. The β-lactamase PCA offered different ways of fusing the coiled-coil domains to the enzyme fragments, and all three possible combinations were tested. It was shown that the best results were achieved by fusing the first fragment to the N-terminus of one coiled-coil helix and the second fragment to the C-Terminus of the other helix.
First steps were taken to adapt PCAs for the research of trimeric interactions. A reporter protein, which allows fragmentation in three parts and reassembles only by assistance of oligomerization domains, is a prerequisite for further studies.
The mDHFR PCA was used to analyze the interaction of the AF10 coiled-coil domain (aa 755 – 796) with its wild type binding partners GAS41 and hDOT1L. The coiled coils of these two proteins are longer than the AF10 helix. Binding studies with the PCA system revealed that AF10 interacts with the fourth register (aa 186 – 227) and, with lower strength, also with the third register (aa 179 – 220) of the GAS41 coiled coil. In CD measurements, the dimer of AF10 and GAS41 register three was more stable than the dimer of AF10 and GAS register four. From hDOT1L, the second register of the third coiled coil domain (aa 608 - 649) interacted with AF10, but the interaction was weak compared to GAS41.
Based on the fourth register of GAS41, a peptide library was generated and the corresponding DNA sequence was cloned. From this library, new binding partners for AF10 were selected. Selection performed with the mDHFR assay resulted in enrichment of the peptides AF10win and AF10win2. Using the β-lactamase assay, the sequences blacwin1 and blacwin2 were selected. The winning sequences of the mDHFR PCA were reproducibly truncated at the N-terminus by a deletion in the DNA sequence. The library, however, was shown not to be biased in this way. AF10 was in general a difficult target in mDHFR assays, possible due to unknown side reactions of the AF10-mDFHR1 fusion protein in E. coli. Selection with the β-lactamase assay, which is localized in the periplasm, resulted in sequences of normal length. A sequence selected with the mDHFR-PCA performed poor in the β-lactamase-PCA and vice versa. This proved an influence of the selection system in the selection process, something that should not occur under ideal conditions.
These studies promoted the understanding of interaction principles of coiled coils and the results will provide a starting point for the development of specific inhibitors of AF10. Consequently, interfering peptides recognizing and blocking specific targets might become important in diagnostics and therapeutics.


SWD-Schlagwörter: Coiled coil , Gerichtete Evolution
Freie Schlagwörter (deutsch): AF10 , GAS41 , hDOT1L , Proteinfragment-Komplementierungsassay , Selektion
Freie Schlagwörter (englisch): AF10 , GAS41 , hDOT1L , protein fragment complementation assay , selection
Institut: Institut für Biologie 3
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Arndt, Katja M. (Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.04.2008
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 07.05.2008
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