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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-50265
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/5026/


Mathias, Ulf

Entwicklung neuer in-vitro-Assays zur Bestimmung der Serumproteinbindung und zur Testung von Inhibitoren einer ADP-Ribosyltransferase

Development of new in-vitro assays for the determination of serum protein binding and for testing of inhibitors of an ADP-ribosyltransferase

Dokument1.pdf (2.394 KB) (md5sum: 657b28af223572c2573ce72f1e6b8a6d)

Kurzfassung in Deutsch

Rationale Arzneistoffentwicklung erfordert eine frühe Abschätzung aller Faktoren, die in die erfolgreiche Entwicklung eines Arzneistoffkandidaten eingehen. Neue Methoden zur Targetidentifizierung, Parallelsynthese und High Throughput Screening (HTS) haben die ersten Schritte der Arzneistoffentwicklung deutlich beschleunigt. Der Engpass in der Entwicklung zu einem marktreifen Arzneistoff ist nunmehr oft die Optimierung der pharmakokinetischen Eigenschaften der Arzneistoffkandidaten. Daher sind hochdurchsatzfähige Methoden für pharmakokinetische Parameter (auch ADME/PK Methoden genannt), die eine Testung zu einem möglichst frühen Zeitpunkt erlauben, von zunehmendem Interesse für die Arzneistoffentwicklung. Ein wichtiger pharmakokinetischer Parameter ist die Serumproteinbindung.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Assays zur Charakterisierung der Bindungseigenschaften diverser Arzneistoffe an Humanem Serum-Albumin (HSA) und an α1-saurem Glycoprotein (AGP) entwickelt. Als Messmethode kam Fluoreszenzpolarisation zum Einsatz. Diese beruht auf der Einstrahlung von linear polarisiertem Exzitationslicht und der Messung der Polarisation des emittierten Lichts. Für kleine fluoreszierende Moleküle steigt mit der Bindung an ein Makromolekül die Polarisation, bzw. die mit ihr verwandte Anisotropie, und somit kann letztendlich das Ausmaß dieser Bindung in einem homogenen System ohne Abtrennung bestimmt werden. Als fluoreszierende Sonden für den HSA-Assay wurden verschiedene Dansylaminosäuren eingesetzt, die zuvor als Liganden für Albumin beschrieben worden sind. Dansyl-GABA fand als unselektive Sonde Verwendung, als selektive Sonden wurden Dansyl L Glutamat (Bindungsstelle I) und Dansyl-Sarcosin (Bindungsstelle II) eingesetzt. Dipyridamol wurde im AGP Assay als fluoreszierende Sonde verwendet. In direkten Titrationen wurden zunächst die Dissoziationskonstanten Kd der Sonden an die jeweiligen Proteine bestimmt. In anschließenden Verdrängungsexperimenten wurden IC50-Werte generiert, die nach in der Literatur beschriebenen Korrekturgleichungen in Inhibitionskonstanten Ki umgerechnet wurden. Die erhaltenen Werte korrelierten mit publizierten Daten, z.B. Phenylbutazon im HSA Assay: pKi erhalten: 5,45, pKd Literaturwert: 5,54; Propranolol-HCl im AGP Assay: pKi erhalten: 5,08, pKd Literaturwert: 5,13.


Darüber hinaus wurde in der vorliegenden Arbeit ein homogenes Testsystem für die Bestimmung der Enzymaktivität bzw. für die Suche nach Inhibitoren des Moskitozidal Toxins (MTX) aus Bacillus sphaericus, welches ADP Ribosyltransferaseaktivität besitzt, entwickelt. Dabei kann, im Gegensatz zum bereits etablierten Assay, auf radioaktive Reagenzien verzichtet werden. Verwendung fand hier ein Minimalsubstrat, dessen Umsatz wir durch den Nachweis seines ADP ribosylierten Derivats mittels MALDI TOF MS nachweisen konnten.

Bei der sich anschließenden Hemmstoffsuche in dem entwickelten Assay wurden verschiedene Strategien verfolgt, um die Testpunktanzahl möglichst gering zu halten. Diese waren (i) eine Vorauswahl von Verbindungen einer Substanzbank mittels Virtual Screening, (ii) die Testung von publizierten Inhibitoren dem MTX verwandter Enzyme bzw. Toxine und (iii) ein Focused Library Screening (hier: Kinaseinhibitoren). Es konnten nach Screeningexperimenten und anschließenden IC50 Bestimmungen zwei potentielle Inhibitoren des MTX identifiziert werden: Die Verbindung HKI 055 F03 zeigte im Assay eine IC50 von 28 µM, für die Substanz Biomol D11 wurde eine IC50 von 10 µM bestimmt. Diese Modellstudie erlaubt nun die Anwendung der Methodik auf Enzyme aus humanpathogenen Erregern.


Kurzfassung in Englisch

New methods for target identification, parallel synthesis and high throughput screening have sped up the initial steps of drug discovery considerably. But the bottleneck on the further way to marketable drug has to some extent merely been shifted to the optimization of the pharmacokinetics of drug candidates. The problems encountered in this optimization process are one major reason for the failure of promising compounds in early clinical trials. Therefore, new fast methods for the determination of pharmacokinetics, so called ADME/PK tests, have gained considerable interest over the last years. The binding properties of drugs to serum proteins are one factor among a number of important pharmacokinetic parameters.

The development of new assays for the determination of the binding characteristics of drugs to human serum protein (HAS) and α1-acid glycoprotein (AGP) are described in the present work. Fluorescence polarisation (FP) was used as the measurement method. It is based on the radiation of linear polarized excitation light and measures the degree of polarization of the emitted light. The polarization or the related anisotropy increases with a decrease of molecular rotation which correlates for a small molecule with its binding to a macromolecule; thus, the amount of the bound portion of a drug can be measured in a homogeneous system. In the HSA assay, dansyl GABA was used as a nonselective fluorescent probe, dansyl L glutamate (binding site I) and dansyl sarcosine (binding site II) were applied as selective probes. In the AGP assay dipyridamole was used as fluorescent probe. By titrating a fixed probe/protein mixture with various drug concentrations and nonlinear regression of the data, sigmoidal binding curves and resulting IC50 values were obtained. These values can be converted by mathematically operations provided in the literature to get Kd-values and Ki-values, respectively. The determined dissociation constants correlate well with the published data, e.g. phenylbutazone; pKd-lit.: 5.54, pKi-obtained: 5.45 in the HSA assay and propranolol-HCl; pKd-lit.: 5.08, pKi-obtained: 5.13 in the AGP assay.


Furthermore, a homogeneous assay for the determination of the enzyme activity and for the search of inhibitors of the mosquitocidal toxin (MTX) from Bacillus sphaericus, which features ADP ribosylating activity, was developed. In contrast to an already established assay radioactive reagents are not necessary here. A tripeptide substrate with a fluorescent label was used and its conversion by the enzyme was proved by detection of its ADP ribosylated derivative using MALDI TOF MS.

Before starting the search for inhibitors with the developed assay different strategies to reduce the number of test points to a minimum were pursued. In detail, these were (i) a preselection of compounds of a substance library by virtual screening, (ii) testing of published inhibitors of enzymes which are homologous to MTX and (iii) a focused library screening (here: kinase inhibitors). After screening experiments and IC50 determinations two potent inhibitors of MTX were identified: For the compound HKI 055 F03 an IC50 of 28 µM was obtained, for the compound Biomol D11 an IC50 of 10 µM. This model study can now be adapted to ADP ribosylating enzymes derived from microorganisms pathogenic to humans.


SWD-Schlagwörter: Fluoreszenzpolarisation , High throughput screening , NAD-ADP-Ribosyltransferase , Proteinbindung , Fluoreszenz
Freie Schlagwörter (englisch): serum protein binding , fluorescence polarisation , high throughput screening , ADP-ribosyltransferase , fluorescence intensity
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Jung, Manfred (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.05.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 07.05.2008
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