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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-53129
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/5312/


Stoll, Patrick

Antikoagulation ohne Blutungskomplikationen? : Herstellung und Erprobung eines neuen rekombinanten Fusionskonstruktes, das eine zielgerichtete Antikoagluation ermöglicht

Targeting ligand-induced binding sites on GPIIb/IIIa via single-chain antibody allows effective anticoagulation without bleeding time prolongation

Dokument1.pdf (1.897 KB) (md5sum: e7847eea05ecd6c24c3703299a789db4)

Kurzfassung in Deutsch

In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue Strategie der zielgerichteten antikoagulativen Therapie untersucht. Ein neu kloniertes Fusionskonstrukt, bestehend aus einem single-chain-Antikörper, welcher gegen das LIBS-Epitop des GPIIb/IIIa-Rezeptor gerichtet ist, verbunden mit dem direkten potenten fXa-Inhibitor TAP, wurde neu generiert und eingehend untersucht.
Der scFv-anti-LIBS-TAP ermöglicht durch seine Bindungseigenschaften die zielgerichtete Anreicherung des Faktor Xa-Inhibitors TAP an aktivierten Thrombozyten im Thrombus. Das Fusionskonstrukt scFv-anti-LIBS-TAP kann auf einfache Art und Weise genetisch verändert und in E.coli kosteneffizient hergestellt und über eine Metall-Affinitäts-Chromatographie hochrein aufgereinigt werden. Diese Generation in E.coli ist eine hoch flexible und kostengünstige Herstellungsmethode, welche einfach auch auf industrielle Maßstäbe zu übertragen ist.
Die durchgeführten durchflusszytometrischen Analysen zeigten eindrücklich, dass der single-chain Antikörper scFv-anti-LIBS, aktivationsspezifisch bindet und die Bindung außerhalb der Fibrinogen-Bindungsstelle des GPIIb/IIIa-Rezeptors liegen muss. Außerdem verdeutlichten sie, dass der Antikörperteil des neu generierten Fusionskonstruktes scFv-anti-LIBS-TAP durch die Kopplung mit dem TAP keine Beeinträchtigung der Bindungseigenschaften aufwies. Der Faktor Xa-Inhibitions-Assay zeigte, dass der Antikörperteil keinen wesentlichen Einfluss auf die Inhibition des fXa hat. So wurde in vitro die Funktion des Fusionskonstruktes untersucht.
Die in vivo Untersuchungen an einem Maus-Carotis-Thrombose-Modell zeigten in vivo erstmal den starken antikoagulatorischen Effekt des scFv-anti-LIBS-TAP vergleichbar mit Enoxaparin bzw. rTAP.
Deutliche Unterschiede ergaben sich jedoch was die Blutungszeit angeht. Nicht aktivationsspezifischer mut-scFv-TAP und rTAP sowie Enoxaparin führten zu einer signifikanten Verlängerung der Blutungszeit. Das aktivationsspezifische Fusionskonstrukt scFv-anti-LIBS-TAP jedoch führte nicht zu einer Verlängerung der Blutungszeit.
In dieser Arbeit wurde somit gezeigt, dass es mit Hilfe des Fusionskonstruktes
scFv-anti-LIBS-TAP möglich ist, eine effektive Antikoagulation ohne Verlängerung der Blutungszeit zu erreichen.


Kurzfassung in Englisch

OBJECTIVE: Therapeutic anticoagulation is widely used, but limitations in efficacy and bleeding complications cause an ongoing search for new agents. However, with new agents developed it seems to be an inherent problem that increased efficiency is accompanied by an increase in bleeding complications. We investigate whether targeting of anticoagulants to activated platelets provides a means to overcome this association of potency and bleeding. METHODS AND RESULTS: Ligand-induced binding sites (LIBS) on fibrinogen/fibrin-binding GPIIb/IIIa represent an abundant clot-specific target. We cloned an anti-LIBS single-chain antibody (scFv(anti-LIBS)) and genetically fused it with a potent, direct factor Xa (fXa) inhibitor, tick anticoagulant peptide (TAP). Specific antibody binding of fusion molecule scFv(anti-LIBS)-TAP was proven in flow cytometry; anti-fXa activity was demonstrated in chromogenic assays. In vivo anticoagulative efficiency was determined by Doppler-flow in a ferric chloride-induced carotid artery thrombosis model in mice. ScFv(anti-LIBS)-TAP prolonged occlusion time comparable to enoxaparine, recombinant TAP, and nontargeted mutant-scFv-TAP. ScFv(anti-LIBS)-TAP revealed antithrombotic effects at low doses at which the nontargeted mutant-scFv-TAP failed. In contrast to the other anticoagulants tested, bleeding times were not prolonged by scFv(anti-LIBS)-TAP. CONCLUSIONS: The novel clot-targeting approach of anticoagulants via single-chain antibody directed against a LIBS-epitope on GPIIb/IIIa promises effective anticoagulation with reduced bleeding risk.


SWD-Schlagwörter: Antikörper , Targeted drug delivery , Gerinnungsfaktor X , Blutungszeit , Blutung
Freie Schlagwörter (deutsch): Blutungskomplikationen , Single-Chain-Antikörper , TAP, GP IIb/IIIa , LIBS
Freie Schlagwörter (englisch): Single-chain-antibody , LIBS , GP IIb/IIIa , bleeding complications , anticoagulation , drug targeting
Institut: Medizinische Univ.-Klinik und Poliklinik
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Medizin und Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Peter, Karl-Heinz (Prof. Dr.)
Quelle: ATVB
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 18.06.2008
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