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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-53283
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/5328/


Treiber, Nora

De novo Erzeugung und Strukturanalyse eines Protein-Protein-Kontaktes und Versuche zur strukturellen Charakterisierung der Peroxine PEX19 und PEX3 sowie Kristallstrukturen eines moskitoziden Holotoxins und einer aromatischen Flavin-Monooxygenase

De novo generation and structural analysis of a protein-protein contact; towards structural characterisation of the peroxins PEX19 and PEX3; crystal structures of a mosquitocidal holotoxin and an aromatic flavin monooxygenase

Dokument1.pdf (8.530 KB) (md5sum: fa3ddf4ab93a9d6db6839feaa240169b)

Kurzfassung in Deutsch

Protein-Protein-Interaktionen sind die Grundlage vieler biochemischer Vorgänge in der Zelle, ihr Verständnis auf atomarer Ebene ist jedoch beschränkt. Ein neuer Ansatz, zu einem besseren Verständnis des atomaren Aufbaus von Proteinkontaktflächen zu gelangen, ist der Versuch, einen solchen Kontakt künstlich herzustellen. Dazu wurde das homodimere Enzym Urocanase gewählt, aus dem durch Einbringen von Aminosäuremutationen ein Tetramer erzeugt werden konnte, dessen Struktur bei 2.0 Å gelöst wurde. Dies stellt einen der ersten de novo hergestellten Kontakte dar, die kristallographisch untersucht werden konnten. Durch eine nicht vorhersehbare Bewegung der NAD+-Bindedomäne gegen die Kerndomäne in zwei der Untereinheiten entspricht die Kontaktfläche nicht exakt der geplanten. Die Übereinstimmung ist aber sehr hoch, was die Tauglichkeit der gewählten Strategie zeigt. Die Struktur der tetrameren Urocanase zeigt zudem zusätzliche funktionelle Aspekte der Enzymfunktion auf.

PEX19 und PEX3 sind zwei Proteine, die an den ersten Schritten der Peroxisomenbiogenese beteiligt sind. Beide Proteine wurden rekombinant erzeugt und konnten in großen Ausbeuten und hoher Reinheit isoliert werden. Kristallisationsversuche mit dem cytosolischen Peroxin PEX19 verliefen erfolglos, was vermutlich auf eine sehr flexible Struktur zurückzuführen ist. Von PEX3 ohne die N-terminale Transmembranhelix konnten Kristalle erzeugt und ein initiales Modell durch deren röntgenographische Untersuchung erstellt werden. Dieses ließ sich jedoch aufgrund der starken Verzwillingung der Kristalle nicht abschließend bestätigen.

Die Struktur eines moskitoziden Holotoxins (MTX) aus Bacillus sphaericus, das aus einer ADP-Ribosyltransferase-Domäne und vier potentiell zuckerbindenden Ricin-B-ähnlichen Domänen besteht, konnte bei 2.5 Å gelöst werden. Die Struktur gibt eine mögliche Erklärung für den Hemmmechanismus durch die C terminalen Domänen. Eine mögliche Zuckerbindung sowie der Aufnahmemechanismus werden diskutiert.

2,6-Dihydroxypyridin-3-Hydroxylase aus Arthrobacter nicotinovorans ist eine aromatische Flavin-Monooxygenase, die am Abbau von Nikotin beteiligt ist. Die Struktur des Enzyms konnte bei 2.6 Å gelöst und ein Modell für die Substratbindung erstellt werden. Weitere funktionelle Aspekte wie der Eintritt des Substrats ins aktive Zentrum, die Bindung des Cosubstrats NADH, die Reduktion des Flavins und der Reaktionsmechanismus werden diskutiert.


Kurzfassung in Englisch

Protein-protein interactions are the basis of many biochemical processes in the cell. However, the insight into the principles of protein-protein interactions at an atomic level is limited. A new approach to better understand the atomic characteristics of a protein interface is the attempt to generate an artificial contact. For this purpose, urocanase, a homodimeric enzyme involved in histidine degradation, was chosen. By introduction of amino acid mutations a tetramer could be generated, and its structure was determined at 2.0 Å resolution. This is one of the first de novo generated artificial protein contacts that could also be analysed by x ray diffraction. Due to an unpredictable movement of the enzyme’s NAD+-binding domain relative to the core domain in two of the subunits, the protein interface does not exactly match the planned interface. However, the agreement is very high, demonstrating that the chosen strategy is suitable for generating protein contacts. Furthermore, the structure of the tetrameric urocanase points out additional aspects of the enzymatic function.

PEX19 and PEX3 are two proteins involved in the first steps of peroxisomal biogenesis. Both proteins were produced recombinantly and could be purified with high yields and purity. Crystallisation attempts with the cytosolic peroxin PEX19 were unsuccessful, which is probably due to a highly flexible protein structure. PEX3 without the N-terminal transmembrane helix could be crystallised and an initial model was determined using x-ray diffraction experiments. However, this model could not be verified as the crystals were almost perfectly twinned.

The structure of the mosquitocidal holotoxin MTX from Bacillus sphaericus was determined at 2.5 Å resolution. It consists of a catalytical ADP-ribosylating domain and four ricin-B-like domains that are putative sugar binding domains. The structure gives a possible explanation for the inhibition mechanism that the C-terminal domains exert on the ADP-ribosyltransferase. Furthermore, the putative sugar binding sites are analysed and possible entry mechanisms of the toxin are discussed.

2,6-dihydroxypyridine 3-hydroxylase from Arthrobacter nicotinovorans is an aromatic flavin monooxygenase involved in nicotine degradation. The structure of the enzyme was determined at 2.6 Å resolution and the substrate modelled into the active site. Further functional aspects as the mode of substrate entry, the possible binding site of the NADH cosubstrate, the reduction of the flavin and the reaction mechanism are discussed.


SWD-Schlagwörter: Röntgenkristallographie
Freie Schlagwörter (deutsch): Proteinstruktur , Holotoxin , Proteinkontakte , aromatische Flavin-Monooxygenase , Peroxisomenbiogenese
Freie Schlagwörter (englisch): X-ray crystallography , protein contacts , holotoxin , aromatic flavin monooxygenase , peroxisomal biogenesis
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schulz, Georg E. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 01.07.2008
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