Direkt zum Inhalt | Direkt zur Navigation

Eingang zum Volltext

Lizenz

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-54261
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/5426/


Peintner, Iris

Monooxygenasen als Post-PKS modifizierende Enzyme in der aromatischen Polyketid Biosynthese von Polyketomycin und Simocyclinon D8

Monooxygenases as post-PKS tailoring enzymes in the aromatic polyketide biosynthesis of polyketomycin and simocyclinone D8

Dokument1.pdf (1.942 KB) (md5sum: 0bb72c5bf1041883f27a1e813fa5b54d)

Kurzfassung in Deutsch

Die zentralen Strukturelemente der Sekundärstoffe Polyketomycin und Simocyclinon D8 stammen aus dem Polyketid-Stoffwechsel Typ II zweier Streptomyceten Arten. Die labilen Decaketid-Ketten, bestehend aus zehn Acetat-Einheiten, werden durch zielgerichtete Zyklisierungs- und Aromatisierungsprozesse im Fall des Polyketomycins zum Tetrazyklin-Intermediat und im Fall des Simocyclinon D8 zum Angucyclinon formiert. Die beiden Synthesevorstufen werden durch Anbringen von funktionellen Gruppen über die Post-PKS modifizierenden Enzyme zum jeweiligen antibiotisch aktiven Naturstoff umgewandelt.

Molekularbiologische Untersuchungen zur Biosynthese des Polyketomycins.
Drei Oxygenase-Gene, welche in die Biosynthese des Grundgerüstes von Polyketomycin involviert sind, wurden inaktiviert. Die Produktionsmuster der generierten Mutanten wurden auf Intermediate beziehungsweise Nebenprodukte des Polyketomycins untersucht. Dadurch konnten wichtige Schritte für die Biosynthes des sauerstoffreichen Tetrazyklin-Aglykons aufgeklärt werden. Die einzigartige funktionelle Substitution der inaktivierten Oxygenase PokOI durch eine Zweite ihrer Klasse, PokOII, wurde via Generierung der entsprechenden Doppelmutante bewiesen.
Im Produktionsspektrum der Mutante und des Wildtyps wurde eine neuartige bioaktive Substanzklasse mit einem ortho-Chinon als hervorgehobenem Strukturelement entdeckt. Ihr genetischer Ursprung liegt voraussichtlich auf einem weiteren Biosynthese-Gencluster des Polyketomycin Produzenten.

Molekularbiologische Experimente des Simocyclinon D8.
Durch partielle Inaktivierung der minimalen PKSII-Gene wurde eine Simocyclinon-Nullmutante generiert. Mit Hilfe der Mutante und Fütterungsexperimenten des Tetrangulols konnten neue Derivate detektiert werden. Dadurch wurde eine erfolgreiche Biotransformation der Fremdsubstanz im mutierten Simocyclinon D8 Produzenten erzielt.
Der Gendefekt der CYP 450 Monooxygenase SimA13 führte zu keiner Modifizierung des Produktionsspektrums im Vergleich zu dem des Wildtyps. Vermutlich handelt es sich bei der Nukleotidsequenz simA13, das inmitten des Biosynthese-Genclusters von Simocyclinon D8 liegt, um ein rudimentäres Gen. Die Tatsache, dass die heterologe Expression des Gens in fremden Streptomyceten Stämmen nicht zur Bildung neuer Derivate führte, deutet ebenfalls auf ein nicht funktionelles Gen hin.
Dagegen beeinflusste der Knock-out des FAD-abhängigen Monooxygenase-Gens simA7 die Simocyclinon D8 Biosynthese.


Kurzfassung in Englisch

The secondary metabolites polyketomycin and simocyclinone D8 are produced by two strains of Gram-positive Streptomycetes. The skeletons of these two antibiotics arise from the aromatic polyketide metabolism. The responsible enzymes, polyketide synthases, catalyze sequential decarboxylative condensations between a starter and extender units to yield a linear poly-ß-ketone intermediate. After cyclic and aromatic steps the backbones of tetracyclines, like polyketomycin, or angucyclinones, like simocyclinone D8, are generated. To determine the different mode of actions of these antibiotics, post-tailoring enzymes, e.g. oxygenases, play an important role.

Biogenetic investigations of the polyketomycin biosynthesis.
Three oxygenase genes of the biosynthetic gene cluster of polyketomycin were deleted by targeted gene inactivation experiments (Red®/ET® Recombineering methode). The accumulating compounds in the mutant strains were isolated, extracted and characterized by HPLC-MS, HR-MS and NMR-analysis. Crucial insights into the biosynthetic pathway of the oxygenated polyketide aglycon were performed.
The monooxygenase PokOII substituted the function of the monooxygenase PokOI in the corresponding deletion mutant of pokOI, as indicated by polyketomycin production and verified by generating a double mutant.
A new biological active ortho-quinone, which was first detected in a mutant strain, was isolated. The structure of the compound was elucidated. The compound probably derives from another secondary biosynthetic gene cluster of the polyketomycin producer strain.

Biogenetic experiments of the secondary metabolite simocyclinone D8.
Disruption of minimal PKSII genes caused a simocyclinone non-producing mutant. When the angucycline tetrangulol was fed to the mutant, novel compounds were generated.
A mutant with a deletion in the CYP 450 monooxygenase gene simA13 was still producing simocyclinone D8. Heterologous expression of the gene simA13 in different hosts did not accomplish any visible effect of their secondary metabolism. Thus, simA13 is a “silent” gene, which is not necessarily involved in simocyclinone D8 biosynthesis.
A mutant with a deletion in the FAD-dependent monooxygenase gene simA7 did not show simocyclinone D8 production, indicating that enzyme SimA7 is involved in simocyclinone D8 biosynthesis.


SWD-Schlagwörter: Streptomycetaceae , Antibiotikum , Angucycline , Tetracycline , Polyketid-Synthasen , Oxygenasen
Freie Schlagwörter (deutsch): Polyketomycin , Simocyclinon D8
Freie Schlagwörter (englisch): Streptomycetes , Antibiotic , Tetracycline , Polyketide Synthase , Oxygenase
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.06.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 08.07.2008
Indexliste