Direkt zum Inhalt | Direkt zur Navigation

Eingang zum Volltext

Lizenz

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-55405
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/5540/


Schifter, Christian-Rainer

Untersuchungen zum Einfluss der Größe von Liposomen auf deren Endozytose in verschiedenen Zelllinien

Investigations on the influence of liposomal size on their endocytosis in different cell lines

Dokument1.pdf (7.627 KB) (md5sum: 1368d19d757345bf3ca3022552455c6e)

Kurzfassung in Deutsch

Nanopartikuläre Wirkstoffträgersysteme (NPS) wie Liposomen oder Lipoplexe stellen bedeutende Arzneistoffträger dar, um Wirkstoffe in den Körper zu transportieren. Die Kenntnisse über die Aufnahmewege, das intrazelluläre Schicksal und über die Faktoren, die diese Internalisierungsprozesse bedingen, sind von essentieller Bedeutung für einen effektiven Arzneimitteltransport in die Zielzellen.
Endozytose bezeichnet die aktive Aufnahme von extrazellulärem Material in das Zellinnere. Mehrere Arbeitsgruppen zeigten die Beteiligung endozytotischer Prozesse an Aufnahmevorgängen von NPS in eukaryotische Zellen und ermittelten verschiedene Faktoren, die in der Lage sind, gezielt auf diese Vorgänge einzuwirken. Neben einer Reihe weiterer Parameter ist die Größe der Vesikel als bedeutsam für die Beeinflussung endozytotischer Prozesse beschrieben worden Viele Studien zur größenabhängigen Endozytose sind unter Verwendung von Latexpartikeln mit äußerst enger Größenverteilung entstanden, da Liposomen etc. metastabile Systeme darstellen, deren Größe in Abhängigkeit von der Herstellungsmethode relativ breit verteilt ist.
Ziel der vorliegenden Arbeit war zum einen die Herstellung und Charakterisierung homogener, zum Zellversuch geeigneter Liposomenchargen und zum anderen der Einsatz dieser präparierten Vesikel im Zellmodell, um gezielt den Einfluss von Größe und Lipidzusammensetzung auf Zellaufnahmeprozesse zu untersuchen.
Die Herstellung von Liposomen mit enger Größenverteilung wurde sowohl hinsichtlich der Präparationsmethode als auch der Lipidzusammensetzung variiert. Am zweckmäßigsten erwiesen sich liposomale Zubereitungen aus S75®, die unter Verwendung bestimmter Alkyl-Glucoside bei definierten Umgebungstemperaturen hergestellt wurden. Die Methode der Detergensentfernung bei einer Temperatur von 5 °C erlaubt die Herstellung von Vesikeln, deren Polydispersität auf homogene Größenverteilungen schließen lässt.
Zur Charakterisierung der präparierten Vesikel wurden Größenausschluss-Chromatographie mit anschließender Analyse durch dynamische Lichtstreuung der einzelnen Fraktionen und Asymmetrische Feld-Fluss-Fraktionierung als potente Methoden neben der Elektronenmikroskopie eingesetzt, um genaue Aussagen zur Homogenität der Vesikel zu erhalten. Die S75®-Vesikel erwiesen sich als untoxisch, stabil und für Zellaufnahmestudien geeignet. Durch HPTLC-Analytik wurden geladene Lipidkomponenten im Gemisch S75® identifiziert, die für die beobachtete zelluläre Assoziation verantwortlich sein könnten.
Analysen von Zell-Vesikel-Interaktionen wurden mittels Durchflusszytometrie, Radiomarkierungsexperimenten und Spectral Bio-Imaging an verschiedenen Modellzelllinien durchgeführt. Die Untersuchungen ergaben Unterschiede hinsichtlich des Aufnahmeverhaltens bei Einsatz von S75®-Liposomen unterschiedlicher Größe. Darüber hinaus wurde belegt, dass die Aufnahme in verschiedenen Zelllinien vom Vorhandensein membranständiger Farbstoffe abhängt.
Die vorliegende Arbeit stellt den Einfluss der Größe hinsichtlich des gezielten Designs von NPS für einen effektiven Wirkstofftransport an den Zielort heraus. Genaue Charakterisierungen der eingesetzten Vesikel genauso wie weiterführende Kenntnisse der Faktoren auf zelluläre Aufnahmeprozesse sind unabdingbar für eine Verbesserung des Wirkstofftransportes durch NPS.


Kurzfassung in Englisch

Nanoparticulate drug delivery systems (NPS) such as liposomes or lipoplexes are eminent tools to deliver drug substances into the human body. Extensive knowledge of uptake mechanisms, intracellular fate and factors determining these internalization processes are highly required for effective drug delivery into target cells.
Endocytosis is the active uptake of extracellular material into the cytoplasm. Different working groups demonstrated the participation of endocytic mechanisms in uptake processes of NPS into eukaryotic cells and revealed various factors influencing those activities. Amongst others the vesicle size was described being important to influence endocytic processes. Regarding size-dependent endocytosis several studies showed up using latex beads with narrow size distribution instead of liposomes etc. The latter are known to be metastable systems with sizes varying in a broad manner due to the preparation method.
Aim of this work was the preparation and characterization of homogenous liposome batches ready for cell experiments. Furthermore this work focused on the usage of those prepared vesicles in cell cultures to investigate the influence of size and lipid composition on cellular uptake processes.
The preparation of liposomes with narrow size distributions was investigated regarding different preparation methods and lipid compositions. Best results showed liposomes made of S75®, prepared with alkyl-glucosides at defined temperatures. The method of detergent removal at 5 °C was highly effective to obtain vesicles with polydispersity indices indicating homogenous size distributions.
To characterize the vesicles besides electron microscopy size exclusion chromatography with subsequent analysis of the fractions by dynamic light scattering and asymmetrical field flow fractionation were applied as effective methods to achieve exact insights into vesicle homogeneity. S75®-vesicles were shown to be non-toxic, stable and effective for cellular uptake studies. By HPTLC analysis charged lipid components in the S75®-mixture were identified, possibly being responsible for the demonstrated cellular association.
Vesicle-cell interactions were analyzed by flow cytometry, liquid scintillation and spectral bio-imaging in different cell lines. Investigations showed differences in cellular uptake by application of S75®-liposomes of different sizes. Moreover the uptake into different cell lines was identified to be influenced by fluorescent markers situated inside the liposomal bilayer.
This work demonstrates the influence of size regarding the defined design of NPS for effective drug delivery to the target tissue. Exact characterization of vesicles and detailed knowledge of factors triggering the endocytic machinery are highly required to improve drug delivery by NPS.


SWD-Schlagwörter: Liposom , Endocytose , Gelchromatographie , FFF , Clathrin , Caveolae
Freie Schlagwörter (deutsch): S75
Freie Schlagwörter (englisch): liposomes, endocytosis, size exclusion chromatography, FFF, clathrin, caveolae
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Peschka-Süss, Regine (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.06.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 23.07.2008
Indexliste