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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-56474
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/5647/


Krebs, Simone

Sensitivität und Spezifität des Nachweises grünfluoreszenz-Protein exprimierender Leberzellen in der Durchfluss-Zytometrie

Sensitivity and specifity of facs-analysis for green-fluorescent protein expriming hepatocytes

Dokument1.pdf (1.627 KB) (md5sum: e9a36d791af83ebf0c4597dc3abd57e1)

Kurzfassung in Deutsch

Eines der Hauptprobleme in der Stammzellforschung ist das Ausfindigmachen und die direkte Untersuchung einzelner Stammzellen oder weniger aus ihnen abgeleiteter differenzierter Organzellen. Das Ziel der Arbeit war die Verbesserung und Validierung einer höchst sensiti¬ven Methode zur Erkennung weniger markierter Hepatozyten durch Durchflusszytometrie (FACS). Die vorliegende Dissertation sollte die Voraussetzungen schaffen für eine Analyse der Beteiligung genetisch markierter, das „Green-Fluoresence-Protein“ exprimierender Blutstammzellen an der Leberzellregeneration. Sensitivität und Spezifität des Nachweises „Green-Fluoresence-Protein“-markierter Leberzellen wurden erarbeitet.

Wir benutzten für unsere Versuche transgene C57BL/6 TgN (ACTbEEeGFP)1osb Mäuse (osb-Maus, sog. „grüne Mäuse“), die GFP in Zellen sämtlicher Gewebstypen exprimieren. C57/Bl6J-Mäuse dienten als negative Kontrolle. Weil die FACS-Analytik ein Vorliegen der Testzellen in Einzelzellsuspension voraussetzt, wurde zunächst ein effizientes Verfahren zur Leberzellvereinzelung etabliert. Wir stellten fest, dass die bisher veröffentlichten Standardprozeduren zur Leberdissoziation sehr toxisch sind und zu einer geringen Ausbeute vitaler Zellen führen. Aus diesem Grund wurden zwei Lebergewebsdissoziations-Protokolle erarbeitet. Das eine basierte auf der Verdauung mittels Dispase II, das 80–100% vitale Hepatozyten lieferte, während das andere auf der Verwendung gewebsdissoziations-spezifischer Kollagenasen beruhte und lediglich 40–80% vitale Hepatozyten ergab.

Das FACS erwies sich als eine sehr empfindliche Methode, um den Anteil GFP+ Hepatozyten zu bestimmen. Bis hin zu 5–17 GFP+ Hepatozyten in 1 x 106 Leber-Zellen konnten anhand dieser Methode erkannt werden. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass Blutzellen in Lebereinzelzellsuspensionen, durch FACS eindeutig identifiziert und aussortiert werden können.

Ein Anfärben von Hepatozyten durch Leber-spezifische Antikörper gegen ASGPR-I und ASGPR-II, Albumin und CD26 gelang nicht. Der Anteil vitaler GFP+ Hepatozyten mit Fluoreszenzfärbung war weit geringer als theoretisch berechnet. Möglicherweise trug ein Verlust der Oberflächenantigene während des Prozesses der Zellvereinzelung zu der geringen Sensitivität bei.

Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit Leberdissoziationsprotokolle und ein hochsensitives Nachweisverfahren für genetisch veränderte Hepatozyten etabliert werden. Die vorliegenden Ergebnisse schaffen die Voraussetzung für eine direkte Untersuchung der Beteiligung weniger, genetisch markierter Stammzellen an der Leberzellregeneration.


Kurzfassung in Englisch

A major problem in the stem cell research is the detection and direct analysis of single stem cells and a few organ cells that are derived from the stem cells.
The aim of the present study was to improve and validate the established highly sensitive methods that can recognize a few marked hepatocytes with the help of flow cytometry (FACS). The present thesis aims at developing conditions to study the contribution made by genetically marked bone marrow stem cells exhibiting green fluorescent protein (GFP) in the regeneration of damaged liver. Moreover, sensitivity and specifity of GFP+ hepatocytes in FACS was established.

For our experiments we used transgenic C57BL/6 TgN (ACTbEEeGFP)1osb mice (osb- mouse, so called “green Mouse”),that exhibit GFP in cells of all organs. C57/Bl6J-mice served as a negative control. The precondition for FACS-analysis is the availability of cell suspension in which cells are present in isolated forms. We developed a procedure to dissociate the liver tissue in single cells. We observed that the standard published procedures of liver cell dissociation were not efficient giving low yields of viable cells and they were cytotoxic. This lead to working out of liver cell dissociation protocols. The one was based on dispase II that gave us a yield of 80-100% of viable cells. And the other employed tissue specific tissue dissociation collagenases with a yield of 40-80% of viable cells.

FACS proved to be a highly sensitive method to detect GFP+hepatocytes. With this method we were able to detect 5-17 GFP+ hepatocytes in a suspension of 1 x 106 liver cells. We were also able to demonstrate that the blood cells present in the liver cell suspension can easily be detected and sorted out.

We did not succeed in the staining of GFP+ hepatocytes with liver specific antibodies against ASGPR-I and ASGPR-II, albumin, and CD26. The number of stained GFP+ hepatocytes was much lower than expected based on theoretical calculation. Probably the loss of surface antigens on the hepatocytes was responsible for this low sensitivity.

In our work we were able to establish an effective liver dissociation methodology and a highly sensitive method to detect genetically altered hepatocytes. The presented results establish conditions for studying the involvement of genetically marked stem cells in liver cell regeneration.


SWD-Schlagwörter: Leber , Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer , Grün fluoreszierendes Protein
Freie Schlagwörter (englisch): liver , FACS , green fluorescent protein
Institut: Inst. für Molekulare Medizin und Zellforschung
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Medizin und Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Kalle, Christof von (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.08.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 01.09.2008
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